Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser
Summary
El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.
Abstract
Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es el potencial de toda la vida de lo teleósteos retina retina neurogénesis y regeneración después de daño severo. Investigar los caminos de la regeneración en el pez cebra podría traer nuevas ideas para desarrollar estrategias innovadoras para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en los mamíferos. En este documento, nos centramos en la inducción de una lesión focal en la retina externa en pez cebra adulto por medio de un láser de diodo de 532 nm. Una lesión localizada permite investigar los procesos biológicos que tienen lugar durante la degeneración retiniana y regeneración directamente en el área de daño. Usando la tomografía de coherencia óptica no invasivos (OCT), hemos sido capaces de definir la ubicación de la regeneración posterior área y monitor dañada en vivo. De hecho, la proyección de imagen OCT produce imágenes de alta resolución, transversales de la retina de pez cebra, proporcionando información que antes sólo estaba disponible con análisis histológicos. Para confirmar los datos de OCT en tiempo real, se realizaron cortes histológicos y la respuesta regenerativa después de la inducción de la lesión retiniana fue investigado por immunohistochemistry.
Introduction
La visión es probablemente el sentido más esencial del ser humano y su deficiencia tiene un alto impacto socio-económico. En el mundo industrializado, enfermedades degenerativas de la retina responsables de la mayoría de la pérdida de la visión y ceguera entre la población adulta1. Retinitis pigmentosa (RP) es la causa hereditaria más común de ceguera en personas entre las edades de 20 y 60 años, que afecta a aproximadamente 1,5 millones de personas en todo el mundo2,3. Es una familia heterogénea de enfermedades hereditarias de retinales caracterizada por la pérdida progresiva de los fotorreceptores (PRs) seguida por degeneración del epitelio retiniano del pigmento y, posteriormente, gliosis y remodelación del interior de las neuronas4. El curso de la enfermedad puede explicarse por la pérdida incremental de los dos tipos de células de PR, generalmente a partir de barras, que son responsables de la visión acromática en luz dévil y conos, que son esenciales para color visión y agudeza visual5. Un defecto genético único es suficiente para causar RP. Hasta ahora más de 130 mutaciones en genes de más de 45 se han asociado con la enfermedad6. Esto conduce a diferentes fenotipos de la enfermedad y es una de las razones que la terapia génica no generalizables y así un acercamiento terapéutico complicado. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos generales para el tratamiento de degeneraciones retinianas en cegar enfermedades.
Degeneración retiniana a menudo implica la pérdida de PR; por lo tanto, la muerte celular PR es una característica distintiva de los procesos degenerativos de la retina7. Ya se ha demostrado que estimula la muerte celular de PR Müller glia celular (MC) activación y proliferación8. MCs, el tipo de célula glial importante en la retina vertebrado, se consideraban ser nada más que un “pegamento” entre las neuronas de la retinales. En los últimos años, muchos estudios han demostrado que MCs actuar como algo más que mera estructural de apoyo9. Entre las diferentes funciones, MCs participa también en la neurogénesis y reparación de10. De hecho, en respuesta a factores difusibles de la retina degeneración, MCs aumentan significativamente la expresión de la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP). Por lo tanto, el etiquetado de GFAP puede utilizarse como un marcador de activación de MC como una respuesta secundaria a lesión de retina y degeneración11.
Recientemente, hemos desarrollado una adaptación de la novela de lesión focal usando un laser para inducir la degeneración retiniana en el pez cebra (Danio rerio). Lesión focal es ventajoso para el estudio de ciertos procesos biológicos como la migración de células en el sitio lesionado y la sincronización precisa de eventos que tienen lugar durante la regeneración retiniana12. Además, el pez cebra se ha convertido en importante en la investigación visual debido a las similitudes entre su sistema visual y la de otros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de las retinas de humanas y teleósteos muestran algunas diferencias. Por consiguiente, las retinas de humanos y de pez cebra contienen las mismas clases de células principales en el mismo modelo de capas, donde fotorreceptores sensibles a la luz ocupan la capa más externa, mientras que las neuronas de proyección retiniana, las células del ganglio, residen en el interior capa neuronal, próxima a la lente. Las interneuronas retinianas, amacrinas, bipolar y células horizontales, localización entre los fotorreceptores y del ganglio celular capas13. Además, la retina de pez cebra es dominado por el cono y por lo tanto más cerca de la retina humana que, por ejemplo, la retina roedor intensamente estudiada. Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es la neurogénesis persistente en la retina de peces y la regeneración retiniana después del daño. En el pez cebra, MCs puede dedifferentiate y mediar la regeneración en la retina lesionada14,15. En pollo, MCs tienen cierta capacidad también para volver a entrar en el ciclo celular y dedifferentiate. Después de lesión retiniana en peces adultos, MCs adoptar ciertas características del progenitor y las células madre migran al tejido retiniano dañado y producir nuevas neuronas16. Perfil de expresión génica de MCs mamíferos reveló inesperadas similitudes con progenitores retinianos, y evidencia de potencial neurogénico intrínseco de MCs en pollo, roedor y retina incluso humana crece17. Sin embargo, por qué la respuesta regenerativa en aves y mamíferos es menor comparada con la respuesta robusta en peces no se entiende todavía. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de reparación endógena en el pez cebra puede sugerir estrategias para estimular la regeneración retiniana en mamíferos y humanos. Empleando el mecanismo de reparación endógena de MCs como una herramienta terapéutica para el tratamiento de pacientes con la degeneración retiniana tendría un impacto excepcional para nuestra sociedad.
En el presente, ofrecemos los pasos necesarios para emplear el modelo de la degeneración y regeneración en investigación oftálmica. Nos centramos primero en inducir daño focal en la retina neurosensorial, luego en la proyección de imagen de eventos a la sitio de la lesión y finalmente visualizable de las MCs adyacentes. El protocolo general es relativamente fácil de realizar y abre una amplia variedad de posibilidades para evaluar la retina luego.
Protocol
Representative Results
Discussion
Regeneración, degeneración retiniana en el pez cebra ha sido investigada por diferentes enfoques como de muerte celular mediada por la citotoxina22, lesión mecánica23y lesiones térmicas24. Se empleó un 532 nm diodo láser para dañar la retina de pez cebra. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece varias ventajas. Por ejemplo, creamos rápidamente un área bien definida de lesión localizada en la retina externa, específicamente en la capa de PRs. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Martin Zinkernagel, MD, PhD y Miriam Reisenhofer, PhD por su aportación científica a establecer el modelo y Federica Bisignani su excelente asistencia técnica.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
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