RGB 및 식물 형질 및 생리 적 연구에 대 한 스펙트럼 루트 이미징: 실험적인 체제 및 프로토콜을 이미징

Summary

실험 프로토콜은 RGB와 hyperspectral 화상 식물 루트 시스템을 성장 하는 토양의 평가 대 한 제공 됩니다. RGB 이미지 시간 시리즈 hyperspectral에서 chemometric 정보 검색의 조합 공장 루트 역학에 대 한 통찰력을 최적화 합니다.

Abstract

식물 루트 역학의 더 나은 이해 농업 시스템의 리소스 사용 효율을 개선 하 고 작물 재배 환경 스트레스에 대 한 저항 증가 필수적 이다. 실험 프로토콜은 RGB 및 루트 시스템의 hyperspectral 화상 진 찰에 대 한 제공 됩니다. 접근은 식물 자연 토양에서 완전 개발된 루트 시스템을 관찰 하는 더 긴 시간을 통해 성장 rhizoboxes를 사용 합니다. 실험 설정 됩니다 rhizobox 식물 물 스트레스를 평가 하 고 뿌리의 역할을 공부 하 고 궁 행. RGB 이미지 설치 시간이 지남에 루트 개발의 저렴 하 고 빠른 정량화에 대 한 설명 합니다. Hyperspectral 영상 RGB 색상 기반 임계 처리에 비해 토양 배경에서 루트 분할을 향상 시킵니다. Hyperspectral 화상의 특정 힘은 기능 이해에 대 한 루트 토양 시스템에 chemometric 정보 수집 이다. 이 고해상도 물 콘텐츠 매핑 보여 줍니다. 그러나 스펙트럼 이미징은 이미지 수집, 처리 및 분석 RGB 방식에 비해 더 복잡 합니다. 두 방법의 조합에는 루트 시스템의 포괄적인 평가 최적화할 수 있습니다. 루트 및 지상 특성을 통합 하는 응용 프로그램 예제는 식물 형질 및 식물 생리 연구의 맥락에 대 한 제공 됩니다. 루트 영상의 추가 개선 및 확장 스펙트럼 데이터에서 루트 영역 속성에 유추 이미지 분석 방법의 다른 광원을 사용 하 여 더 나은 조명 RGB 이미지 품질을 최적화 하 여 얻을 수 있습니다.

Introduction

뿌리의 저장 등의 식물에 대 한 몇 가지 필수 기능을 제공 동화 한다, 토양, 및 통풍 관 지구 식물의 앵커리지와 물과 영양소¹의 전송. 진화 관점에서의 루트 축 형성 땅 식물²의 기원에 대 한 기본 전제 조건으로 간주 됩니다. 이 중요 한 역할에도 불구 하 고 역사적으로 뿌리 생물학 연구에만 한계 위치를 점령 했습니다. 그러나 더 최근에,, 거기는 증가 그림1에서 입증 공장 루트 시스템에 과학적인 관심사.

그림 1: 루트 식물 과학에 있는 연구의 관련성.
루트의 수는 지난 년간 SCI 저널에 모든 게시 된 식물 연구의 연구를 관련. Scopus 키워드 "공장" 및 "공장 및 루트"를 사용 하 여에서 결과 검색 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

두 가지 주요 이유는 루트 연구의 최근 발전 기초를 가설 수 있습니다. 첫째, 지상파 식물 글로벌 변경³결과로 더 자주 환경 스트레스에 노출 됩니다. 농업 작물 생산의 맥락에서 그것은 세계적으로 약 30%의 농업 지역 물과 인^4,5에 의해 제한 됩니다 추정. 수확량의 스트레스 감소는 세계적으로 낮은 50 %rainfed 농업 생태계⁶에 대 한 잠재적인 생산성의 추정 되어 상당한 수익률 격차에 대 한 주요 이유. 낮은 리소스 가용성, 외이 가난한 리소스 사용 효율, 즉 부족 한 수 식물의 사용 가능한 리소스⁷악용 관련이 있습니다. 이 다른 생태계에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 질산염 등 모바일 자원의 손실에 결과. 예를 들어 현재 글로벌 질소 이용 효율 47⁸추정 됩니다. 더 나은 자원 사용 효율성 향상 된 관리 방법 및 재배 이므로 모두 높은 중요성의 성장 환경 지속 가능성 뿐만 아니라 농업 출력의 지속. 이 컨텍스트 식물에서 뿌리 향상 된 작물 및 자르기 시스템^9,10에 대 한 주요 대상으로 간주 됩니다.

식물 뿌리에 최근 관심사에 대 한 두 번째 중요 한 배경 측정 방법에 기술적 진보 이다. 루트 방법을 두 가지 주요 과제에 의해 제한 오래 있다: 그들은 주로¹¹, 세척 하 여 정량화에 대 한 격리 해야 했다 토양에서 성장 하는 식물에서 뿌리의 측정에 대 한 그로 인하여 방해 루트 축의 건축 배열. 발굴을 사용 하 여 제자리에 루트 관찰 함으로써 토양에서 뿌리의 자연 스러운 위치를 보존 하는 방법 식물 설명¹²사용 되 고 있다. 아직도 그들은 매우 시간이 걸리는 고 따라서 비교 구조 기능 루트 시스템 분석의 처리량 요구 사항을 충족 하지 않습니다. 다른 한편으로 높은 처리량 방법 루트 건축 측정 했다 주로 수행 인공 미디어에 묘 종 식물¹³ 식물의 자연 성장과 환경 추정 의심¹⁴가.

루트 연구의 최근 붐 이미징 방법¹⁵에 사전에 긴밀 하 게 연결 된다. 접근 루트 연구에서를 이미징 세 가지 유형으로 대략 그룹화 될 수 있습니다. 우선 CT 및 MRI¹⁶같은 고해상도 3D 방법이 있다. 이러한 메서드는 가뭄 유도 xylem 폐색전증¹⁷와 같은 흙과 식물 뿌리의 상호 작용 과정 연구에 가장 적합 한. 일반적으로 그들은 그들은 상세한 관측을 허용 하는 비교적 작은 샘플에 적용 됩니다. 다른 크기의 냄비와 잘 루트 이미징에 대 한 CT와 MRI의 비교는¹⁸에 제공 됩니다. 둘째, 높은 처리량 이미징 방법^19,20있다. 이러한 메서드는 대부분에 따라 일반적인 2D RGB 영상 인공 미디어 (젤, 발 아 종이)에 성장 하는 뿌리의 고대비 뿌리와 배경 사이의 비교적 간단한 해 부를 허용 하는 곳. 그들은 다른 작물 genotypes 표준화 된 인공 성장 조건¹³에서 종묘 루트 특성 중 높은 처리량 비교를 위해 적합 하다. Rhizobox 메서드는이 두 가지 방법 사이: 그들은 더 긴 기간 동안 토양에 성장 하는 뿌리의 2D 이미지를 사용 하 고 중간 처리량^21,22. (2D) 루트 이미징에 대 한 최근 도전 캡처 또한 구조²³의 설명 외에도 루트 기능 지표입니다.

현재 신문에서 우리는 rhizobox 성장 (i)는 저렴 하 고 간단한 주문 품 RGB 이미징 설치 및 (ii)는 더 복잡 한 적외선 이미징 설치 프로그램을 사용 하 여 루트 시스템 이미징을 위한 실험 프로토콜 제시. 이러한 두 설정에서 예제 결과 표시 되며 식물 형질 및 식물 생리 연구의 맥락에서 논의.

Protocol

1. 식물 성장을 위한 뿌리 상자

참고: 실험 시스템은 뿌리 이미징을 위해 식물을 성장시키기 위해 뿌리 상자를 사용합니다. 먼저 상자의 디자인과 사용된 기판에 대해 설명한 다음 충전 절차에 대한 세부 정보를 제공합니다.

1. rhizoboxes의 디자인
   1. 15mm 강도의 회색 PVC로 만든 백 플레이트와 측면 프레임이 있는 rhizobox(그림 2)를 만듭니다. 300mm x 1000mm의 상자 크기를 사용하십시오. 전면 창의 경우 금속 레일을 측벽에 나사로 고정하여 PVC 프레임에 부착하는 6mm 미네랄 유리를 사용합니다.
   2. 과도한 물을 배수할 수 있도록 하단 프레임에 세 개의 구멍을 만듭니다. 이 구멍은 플라스틱 나사로 선택적으로 닫을 수 있습니다.
   3. 채우기 전에 PC 멀티월 시트를 삽입하여 rhizobox의 내경(10mm에서 30mm 사이)을 조정합니다. 전체 시스템의 무게를 줄이기 위해 대부분의 작물에 10mm의 내부 공간이 권장됩니다 (토양이없는 뿌리 상자 무게는 13.2kg).

그림 2: Rhizobox 실험 시스템 및 그 구성 요소.
왼쪽 그림은 리조박스의 치수를 보여주고 오른쪽 그림은 측면 프레임이 있는 회색 PVC 후면 플레이트, 전면 미네랄 유리, 전면 유리를 후면 구획에 고정하기 위한 다양한 내경 및 금속 각도를 위한 다중 벽 시트입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 기판
   1. 뿌리 줄기 상자를 2mm 입자 크기로 체질한 밭 토양(이 실험의 경우: 석회질 체르노젬의 미사 양토 표토)으로 채웁니다.
   2. 미리 젖은 기판을 사용하여 수평 위치에서 내부 구획(측면 프레임이 있는 후면 플레이트)에 기판을 채우기 위한 rhizobox를 엽니다. 상부 개구부를 통해 기판을 부어 수직 위치에서 채울 때 발생하는 미세한 입자와 거친 입자 사이의 층화 및 분리를 피하기 위해 수평으로 충전하십시오.
   3. 채우기 전에 기판을 미리 적시십시오. 기질의 유형(특히 미사 및 점토 함량)에 따라 번짐 및 구조 저하를 방지하기 위해 0.12-0.18cm³*^cm-3의 수분 함량을 초과하지 마십시오. 기질을 rhizoboxes.
      에 채운 후 사전 혼합과 목표 수분 함량의 차이를 추가합니다. 알림: (오븐)건조 기질로 채우고 이후에 전체 물을 추가하는 것은 기질의 강한 침전과 큰 균열의 형성을 초래할 수 있으므로 권장되지 않습니다.
2. 단계별 충진 예제
   1. 목표 수분 함량을 정의합니다. 여기에서 처음에는 식물이 물 부족을 겪지 않는 80% 식물 사용 가능 물(PAW)로 설정됩니다.
   2. 기판의 전계 용량(FC)과 영구 시들음점(PWP)을 결정합니다. 여기에서 리조박스와 동일한 높이(100cm)의 PVC 튜브를 사용하여 FC를 얻습니다.
      1. 작은 배수구가 있는 수염으로 바닥의 튜브를 닫고 더 미세한 기판에서 구멍이 닫히지 않도록 1cm의 자갈을 추가하고 rhizobox(^1.3g-3)에 사용된 것과 동일한 부피 밀도로 기판을 채웁니다.
      2. 배수가 발생할 때까지 튜브를 물로 포화시키고 이틀 동안 평형을 이루도록 두고(결과 수분 함량은 정의에 따라 필드 용량과 동일함) 증발을 방지하기 위해 상단 개구부를 접착 필름으로 덮습니다. 이 실험에서 토양에 대해 달성된 필드 용량 값은 0.357cm ^3cm-3.
         였습니다. 참고: PWP의 수분 함량은 표준 토양 물리적 방법(예: 압력판 측정²⁴) 또는 텍스처 기반 pedotranfer 함수^{25를 통해 미리 알아야 합니다}. 여기서 사용되는 토양의 경우 0.12cm ^3cm-3과 같습니다.
      3. 압력판 추출로 FC를 측정할 때도 rhizobox 형상(높이 100cm = 100hPa)에 해당하기 위해 h=-330hPa가 아닌 h=-100hPa의 매트릭스 전위에서 수분 함량을 취합니다.
      4. 80% PAW에서 수분 함량(WC)을 계산합니다: WC(cm ^3cm-3) = 0.80(FC-PWP) + PWP. 여기에 사용 된 토양의 수압 한계에 대해 이것은 0.31cm ^3cm-3의 80 % PAW에서 체적 수분 함량을 제공합니다.
      5. 2850cm³ (너비 30cm, 내부 공간 1cm, 높이 95cm, 상단 5cm는 급수를위한 기질이 없음)의 뿌리 줄기 상자 부피에 대한 물의 양을 계산합니다. 이것은 883.5 cm³ 의 물의 부피를 제공합니다 883.5 g 물의 밀도는 20 ° C에서 1.0 g ^cm-3 입니다.
   3. 리조박스를 채울 벌크 밀도(d_b)를 정의합니다. 여기에서는 1.3g ^cm-3로 설정하여 일반적으로 농업 밭 토양에서 발견되는 값에 해당합니다. 이_{d b}에서 2850cm³의 리조 박스 부피를 채우는 데 필요한 건조 기질의 양은 3705g의 건조 토양과 같습니다.
   4. 마른 토양 3705g에 물 400g을 첨가하여 건조한 토양을 0.108g ^g-1(체적 수분 함량 0.14cm ^3cm-3)의 중량 측정 수분 함량으로 미리 적시고 부드럽게 혼합하여 균일한 수분 분포를 얻습니다. 입자 크기를 2mm≤ 유지하기 위해 더 큰 응집체를 수동으로 파괴합니다.
   5. 미리 적신 토양을 열린 뿌리 줄기 상자에 채우고 폴리스티렌 시트(30 x 10 x 1.5cm)를 사용하여 상자 내부 부피를 덮어 부드럽게 압축하여 1.3g ^cm-3의 균일한 db를 만듭니다.
   6. 남은 물량(483.2g)을 추가하면 스프레이 병으로 표면에 분사하여 0.31cm ^3cm-3의 목표 수분 함량을 달성합니다. 표면 구조 저하 및 균일한 습윤을 방지하기 위해 작은 입자 크기를 확인하십시오. 분무하는 동안 상자의 균형을 유지하여 실제로 기판에 추가된 물의 양을 모니터링하십시오.
   7. 물을 10분 동안 재분배한 다음 유리를 표면에 누르고 측면 금속 레일로 고정합니다. 젖은 기질이 있는 뿌리 줄기 상자의 평균 최종 중량은 17818 ± 68 g (13230 g 뿌리 상자 무게 + 3705 g 건조 토양 + 물 883 g)이었습니다.
      알림: 수평 상자에 채워진 균일한 수분 함량은 결과적인 잠재적 구배에 따라 상자가 최종 위치에 설정될 때 재분배됩니다. 이것은 모든 식물 성장 화분에서 기하학(높이)에 따른 물리적 과정이며 실험자는 화분 유압^{26에 대해 의식해야 합니다}.

2. 공조실 설정

1. 최적의 식물 성장을 위해 440(파란색) 및 660nm(빨간색)의 스펙트럼 피크와 함께 450μmol ^{m-2 s-1}의 균일한 조명을 제공하는 8개의 LED 램프(그림 3)를 기후 실내에 장착합니다.

그림 3: 응력 실험을 위한 리조박스가 있는 기후 챔버.
(A) LED 조명, 기상 관측소 및 PC가 있는 전체 챔버의 왼쪽 모습(여기서는 잎 습도계 벌목용); 45° 경사로 rhizobox를 들고 있는 금속 프레임과 빛에 대한 rhizobox 유리 창을 숨기는 데 사용되는 나무 판의 클로즈업으로 오른쪽보기. (B) 사탕무를 사용한 스트레스 실험: 서로 다른 대기 수요(높음/낮음)와 토양 수분 가용성(높음/낮음)으로 인한 스트레스와 4단계를 결합합니다. 평균 기공 전도도의 녹색 막대는 식물 스트레스 반응을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 플랜트/실험 요구 사항에 따라 주변 매개변수를 설정합니다. 여기에서 조명을 위해 14시간 조명과 10시간 어둡게 사용합니다. 플랜트 설립 중 및 응력 처리가 시작되기 전에 온도를 낮에는 20°C, 밤에는 15°C로 설정하고 상대 습도를 50 ± 8%로 유지하십시오.
2. 적절한 금속 프레임워크를 사용하여 뿌리 줄기 상자를 45° 경사로 놓습니다. 이것은 중력작용으로 인해 유리 표면을 향한 뿌리 성장을 최대화합니다.
3. 유리창을 나무판으로 덮어 뿌리 영역을 어둡게 유지하고 유리 표면을 통해 투과하는 빛으로 인한 조류 성장을 방지합니다.

3. 사탕무 예제 설정 및 트리트먼트

1. 라디클이 나올 때까지 인큐베이터에서 20°C에서 3일 동안 젖은 여과지에 사탕무 씨앗을 미리 발아시킵니다. 이것은 생존 가능한 식물로 파종을 보장합니다.
   알림: 발아 활력이 높은 식물에는 사전 발아가 필요하지 않으므로 파종 시 라디클이 손상될 위험을 피할 수 있습니다. 그러나 두꺼운 과피를 가진 사탕무 씨앗의 경우 생존 불가능한 씨앗의 위험이 높고 발아 전 발아는 토양에 직접 파종하는 것에 비해 라디클의 출현을 크게 가속화합니다.
2. 드라이버로 뿌리 상자 중간에 약 1.5cm 깊이의 흙 깊이까지 작은 구멍을 뚫고 라디클이 아래쪽을 향하게 한 핀셋을 사용하여 유리창 옆에 씨앗 하나를 놓고 (초기 가시성 향상) 흙으로 부드럽게 덮습니다.
3. 토양 위에 0.5cm의 미세한 자갈 층(2-4mm)을 추가하여 관개 중 토양 응집체가 부딪히지 않도록 보호하고 증발 손실을 줄입니다. 출현을 용이하게 하려면 씨앗이 배치된 곳에 자갈이 없는 토양 표면을 유지하십시오.
4. 확립을 향상시키기 위해 물 10g을 추가하십시오.
5. 확립 및 초기 성장 기간 동안 실험적 스트레스 치료가 시작될 때까지 2-4일마다 뿌리 줄기에 관개하여 초기 수분 함량을 80% PAW로 유지합니다.
   1. 리조박스의 무게를 측정하고 각 개별 상자의 초기 중량에 도달할 때까지 물을 추가하여 필요한 관개 용수의 양을 결정합니다. 수동 관개의 경우 피펫을 사용하여 물을 뿌리는 동안 표면 구조 저하를 방지하십시오.
6. 기후실에 확립된 디자인에 따라 뿌리 상자를 배열합니다. 여기에 보고된 프로토콜은 완전 무작위 설계(CRD)에서 5회 반복하여 6개의 사탕무 품종을 사용한 실험을 기반으로 합니다.
   1. 무게를 측정하고 물을 주기 위해 금속 홀더에서 꺼낼 때마다 rhizobox의 위치를 바꾸십시오. 이것은 기후 공간 내부의 잔류 (빛) 불균일성의 영향을 방지합니다.
7. 스트레스 치료가 시작되는 시간과 스트레스 유형을 정의합니다. 여기에는 다음 설정(그림 4)이 사용됩니다.
   1. 뿌리가 뿌리 상자 깊이의 약 75%를 덮고 잎에서 측정하기에 충분히 발달한 캐노피로 BBCH 15(5개의 잎이 펼쳐진 상태)에서 측정을 시작합니다. 각 s를 유지하십시오tage는 새로운 설정에 적응하고 측정을 수행할 수 있도록 최소 3일 동안 수행합니다.
   2. 비응력 관찰의 경우 최적의 토양 수분(80% PAW) 및 주변 조건(20°C/15°C 온도, 50 ± 8% rH)으로 초기 설정을 유지하여 1.28 ± 0.1kPa의 주간 증기압 부족(VPD)을 제공합니다(그림 3 C 참조).
   3. 토양 수분을 80% PAW로 유지하면서 온도를 27°C/20°C로 높이고 rH를 35%로 줄여 대기 수요를 2.45 ± 0.4kPa의 주간 VPD로 높입니다.
   4. 그런 다음 관개를 보류하여 rhizobox를 0.215cm^{, 3cm-3}의 수분 함량에 해당하는 40% PAW로 건조합니다. 낮은 대기 수요(VPD 1.28kPa)로 초기 주변 조건을 재설정합니다.
   5. 대기 수요를 2.45kPa의 VPD로 증가시키는 응력을 결합하고 토양 수분을 40% PAW로 유지합니다.

4. 루트 이미징 방법

1. 이미징 방법을 결합하여 각각의 장점을 활용하고 대상 정보에 따라 달라집니다.
   1. VIS 범위에서 RGB 이미징을 적용하여 시간 경과에 따른 뿌리 성장, 구조 및 형태를 추적하며, 이는 암시적으로 빈번한 측정이 필요합니다. RGB 이미징의 장점은 (i) 저렴한 비용, (ii) 빠른 이미지 획득, (iii) 하드 디스크 공간(이미지 크기: 48MB)에 대한 낮은 요구 사항 및 (iv) 고해상도(3648 x 5472 픽셀)입니다.
   2. 뿌리와 토양의 화학계량학적 특징이 필요한 경우 NIR 범위에서 초분광 이미징(HSI)을 사용합니다. 장점은 (i) 뿌리와 토양 배경 사이의 분할을 위한 스펙트럼 특징과 (ii) 물리화학적 시스템 특성(예: 토양 수분 함량, 뿌리 나이)에 대한 접근입니다. 단점은 (i) 스캔 시간이 길고(리조박스당 약 16분), (ii) 데이터 세트 크기가 크고(리조박스 이미지당 13.7GB), (iii) NIR 카메라의 해상도가 낮고(320 x 256 픽셀), (iv) 데이터 분석의 복잡성이 높다는 것입니다.
2. RGB 루트 이미징
   1. 주변광을 차단하고 너비 1m, 높이 1m의 금속 프레임과 판자로 늘어선 측벽으로 구성된 카메라 위치를 고정하는 이미징 상자(그림 4)를 사용합니다. 프런트 엔드에서 리조박스에서 80cm 떨어진 두 위치에 카메라를 고정합니다.
      1. 투명 접착 테이프로 rhizobox 프레임에 테이프라인을 부착하고 이미징 상자의 홀더에 rhizobox를 놓습니다.
      2. 뿌리 상자에서 80cm 거리에 부착된 24개의 W 형광등을 사용하여 뿌리 상자를 비춥니다. 또한 뿌리 상자로부터 20cm 떨어진 곳에 4개의 15W UV 튜브를 장착 하여 뿌리와 (밝은 색의) 기판 배경 사이의 대비가 낮은 경우 뿌리 자동 형광을 사용하는 대체 조명으로 사용합니다.
      3. 약 3cm의 겹침으로 rhizobox의 위쪽과 아래쪽 절반을 덮기 위해 두 개의 이미지(위쪽 및 아래쪽 위치)를 찍습니다.
   2. 이미징 박스의 각 위치에 퀵 릴리스 플레이트로 고정되는 디지털 일안 리플렉스 카메라로 RGB 이미지를 획득합니다.
      1. 형광등 튜브를 사용할 때 다음 설정을 적용하십시오. 이러한 예제 설정을 조정하여 치수와 조명, 카메라 모델의 변경 사항을 확인합니다.
         1. 카메라 대상에서 자동 초점과 스태빌라이저를 끕니다. 카메라를 수동 모드로 설정합니다.
         2. ISO 감도를 500으로 설정합니다. 셔터 속도를 13으로 설정합니다. 조리개를 5.6으로 설정합니다.
         3. 미러 잠금 장치를 끕니다. 화이트 밸런스를 자동 화이트 밸런스로 설정합니다.
      2. UV 튜브를 사용한 조명에는 다음 설정을 사용합니다.
         1. 카메라 대상에서 자동 초점과 스태빌라이저를 끕니다. 카메라를 수동 모드로 설정합니다.
         2. ISO 감도를 1000으로 설정합니다. 셔터 속도를 13으로 설정합니다. 조리개를 5.6으로 설정합니다.
         3. 미러 잠금 장치를 끕니다. 화이트 밸런스를 형광(Fluorescence)으로 설정합니다.
   3. rhizobox의 상단과 하단의 RGB 이미지를 단일 이미지 사진 편집기(예: Adobe Photoshop)로 병합합니다. 리조박스의 측면 프레임에서 테이프라인을 사용하고 겹치는 개체(뿌리 및 토양 피쳐)를 제어합니다.
      1. 각각 픽셀 크기가 3648 x 5472인 두 개의 개별 이미지를 크기가 3648 x 10944 픽셀이고 배경이 흰색인 새 파일에 복사합니다.
      2. 한 이미지의 레이어 불투명도를 60%로 줄이고 이미지의 겹치는 부분(테이프라인, 개체)을 정렬합니다. 그런 다음 레이어 불투명도를 100%로 복원합니다.
      3. 이미지의 눈금자에 따라 뿌리가 없는 이미지 상단에 정확히 1cm의 빨간색 선 두 개를 추가합니다. 이러한 선은 나중에 이미지 분석 시 길이 치수를 수정하기 위해 이미지 크기를 조정하는 데 사용됩니다.
      4. 자르기 도구를 사용하여 모든 레이어를 병합하고 흙으로 채워진 창 외부의 이미지 부분을 제거합니다.
      5. 추가 분석을 위해 이미지를 tiff 파일로 저장합니다.
      6. UV 조명이 있는 이미지의 경우 도구 모음 조정-흑백 을 사용하여 저장하기 전에 색상을 회색조로 줄이고 사전 정의된 고대비 파란색 필터를 선택합니다.
   4. 뿌리와 토양 배경 간의 세분화와 관심 있는 뿌리 특성(예: 길이, 표면, 직경, 분기)의 정량화를 위해 모든 뿌리 분석 소프트웨어를 사용하십시오(사용 가능한 도구는 www.plant-image-analysis.org 참조). 여기서는 WinRhizo가 사용됩니다.
      1. rhizobox tiff-image를 엽니다.
      2. 이미지에 추가된 스케일링 막대를 사용하여 이미지의 길이 스케일을 보정합니다.
      3. Analysis 메뉴에서 Root & Background Distinction을 선택하는 Based on Color를 선택합니다.
      4. 뿌리와 토양(배경)에 해당하는 색상 등급이 있는 보정 파일을 정의합니다. 여기에 사용된 예시 이미지(그림 8 참조)의 경우 세 가지 루트 색상 클래스(old laterals, young laterals, tap root)와 세 가지 토양 색상 클래스가 정의됩니다.
      5. 그레이스케일 이미지(UV 조명)의 경우 Root & Background Distinction(루트 및 배경 구분) 메뉴에서 (i) Based on grey levels(회색 수준 기준) 및 (ii) Pale Root on Black Background(검은색 배경에 창백한 뿌리)를 선택하고 분할을 위해 로컬 Lagarde intensity threshold를 사용합니다.
      6. 결과가 저장되는 데이터 파일을 엽니다.
      7. 해석을 실행한 후 일치하지 않는 영역(예: 가장자리)이 있는지 여부를 제어합니다. 이 경우 제외 영역을 정의하고 분석을 다시 시작합니다. 분류되지 않은 루트의 경우 색상 클래스를 더 추가하고 분석을 다시 시작합니다. 루트로 잘못 분류된 요소의 경우 Debris & Rough Edges 필터링 옵션을 활성화/늘리십시오.

그림 4: RGB 리조박스 사진을 획득하기 위한 이미징 박스.
내부에 광원이 있는 이미징을 위해 rhizobox가 부착된 전면의 왼쪽 모습; 카메라가 장착된 뒷면의 오른쪽 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 초분광 루트 이미징
   1. 하드웨어 설정
      1. (i) 900 nm - 1700 nm, 320 x 256 픽셀 및 100Hz의 프레임 속도를 가진 열전기 냉각 14비트 흑백 NIR 카메라와 (ii) 900 nm - 2500 nm의 스펙트럼 범위와 3.6 nm의 스펙트럼 해상도를 가진 이미징 분광기로 구성된 초분광 루트 이미징 시스템(그림 5)을 사용합니다. 할로겐 라인 조명 소스(4개의 50W 할로겐 스폿)를 45°/-45° 형상으로 배열합니다. 이미징 센서를 2축 포지셔닝 시스템에 장착합니다. 스캔 창의 크기는 240 x 1000mm이며, 즉, 리조박스의 각 가장자리에서 30mm는 이미지에 포함되지 않습니다.
      2. (i) 백색 및 암흑 표준 획득, (ii) 카메라 통합 시간 설정, (iii) 공간(픽셀 크기 0.1mm, 픽셀 크기 1.0mm) 및 스펙트럼 해상도(3.6nm 해상도의 모든 222개 스펙트럼 대역, 54개 대역 및 14.8nm 해상도의 평활화된 스펙트럼) 선택, (iv) 리조박스의 스캔 영역 정의.
      3. 이미지를 SIF 파일로 저장합니다. 대용량 파일을 저장하는 동안 발생하는 문제를 방지하려면 스캔한 각 이미지 보폭(리조박스당 9보폭)을 4개의 세그먼트(300mm 길이 3개, 100mm 길이 1개)로 세분화하고 보폭(1-9)과 부분(1-4), 날짜 및 시간(YYYY)으로 구성된 고유한 파일 이름으로 별도로 저장합니다. MM.DD HH:MM:SS)입니다. 전체 rhizobox 스캔에는 13.7GB의 하드 디스크 공간이 필요합니다.
   2. 이미지 획득 및 분석.
      참고: 그림 6은 이미지 획득, 세분화 및 분석 단계를 보여줍니다.
      1. 이미지 획득은 최적의 이미지 품질을 위한 카메라 설정 선택과 스캔 매개변수 정의로 구성됩니다.
         1. 카메라 소프트웨어에서 rhizobox 스캔과 백색 표준에 대한 카메라 통합 시간을 결정합니다.
            1. 이미징 GUI를 열고 뿌리가 있는 rhizobox의 위치로 카메라를 이동합니다.
            2. 가벼운 물체(즉, 루트)를 대상으로 하는 카메라의 통합 시간을 카메라의 전체 다이나믹 레인지의 약 85%가 소프트웨어에 의해 표시되는 히스토그램에서 사용되는 방식으로 조정합니다. 카메라 포지셔닝 시스템을 흰색 표준을 대상으로 이동하여 흰색 표준에 대해 반복합니다. 그런 다음 카메라 소프트웨어를 닫습니다.
         2. Matlab Imaging GUI를 열고 현재 rhizobox 스캔에 대한 모든 설정을 지정합니다. 여기에 보고된 데이터의 경우 다음 설정을 사용합니다.
            통합 시간 흰색 표준: 1000
            통합 시간 rhizobox: 4000
            스펙트럼 해상도: 전체 해상도(즉, 222개의 협거리 스펙트럼 대역)
            전체 공간 해상도(픽셀 크기 0.1mm)
            1. 각 이미징을 실행하기 전에(예: 하루에 한 번) 어두운 색과 흰색 표준을 획득합니다. 어두운 표준은 카메라 노이즈를 나타내고 흰색 표준은 최대 반사율을 나타냅니다. 이러한 데이터는 전처리 중 이미지 정규화에 필요합니다.
            2. 리조박스(rhizobox) 전체를 스캔할지 아니면 일부만 스캔할지 정의합니다. 현재의 경우 전체 rhizobox가 이미지화됩니다. 그런 다음 스캔을 시작합니다.
      2. Matlab 스크립트로 이미지를 처리합니다. 스크립트에 의해 수행되는 작업은 다음과 같습니다.
         참고: 스크립트는 현재 문서화되지 않은 버전이며 교신 작성자로부터 얻을 수 있습니다. 적절한 문서화가 완료되면 교신저자의 기관(www.dnw.boku.ac.at/pb/)의 웹사이트에서 다운로드할 수 있습니다.
         1. 뿌리 상자 중심(뿌리 포함)에서 전체 이미지 보폭을 구성하여 보폭의 네 부분을 병합합니다.
            참고: 이 단계에서는 파일 크기로 인해 Matlab의 각 계산 단계에 시간이 많이 걸리고 하나의 중앙 보폭에 포함된 정보가 이미지 분석의 첫 번째 단계에 충분하므로 전체 리조박스(즉, 9개의 보폭 모두)의 스펙트럼 이미지를 사용할 필요도 권장하지 않습니다.
         2. 획득한 어두운 표준과 흰색 표준을 사용하여 이미지를 정규화하고 파일에서 스캔하는 동안 자동으로 저장되는 흰색 표준 및 리조박스 스캔의 서로 다른 통합 시간을 고려합니다.
         3. 선택적으로 스무딩 필터를 적용하여 이미지에서 노이즈를 제거합니다. 이 스크립트는 현재 3x3 커널 중앙값 필터링 및 다중 산란 보정을 제공합니다. 여기에 제시된 이미지 평가의 경우 필터가 적용되지 않습니다.
         4. 기록된 모든 스펙트럼 대역에서 이미지를 표시하여 첫 번째 통찰력을 얻고 관심 영역을 선택하기 위해 표시할 파장을 결정합니다(이미지 분할 참조).
      3. 다음 단계에 따라 별도의 스크립트에서 뿌리와 토양 배경 사이의 세분화를 수행합니다.
         1. 뿌리와 토양에 대한 관심 영역(ROI)을 선택하여 분할을 위한 스펙트럼 특징을 찾습니다. 자유형 선택 도구를 사용하여 이전에 뿌리와 토양 간의 적절한 대비로 식별된 파장으로 표시된 이미지에 ROI를 표시합니다. 여기에서 뿌리(Old and Young laterals, tap root)에서 3개의 ROI를 사용하고 토양(건조하고 습한 지역)에서 2개의 ROI를 사용합니다.
         2. 선택한 ROI가 있는 사각형을 표시하고 나머지 부분은 블랙 마스크로 표시하고 모든 파장에서 선택한 ROI 이미지를 시각화합니다.
         3. 스펙트럼 명암 = 0(검은색 픽셀)인 픽셀을 포함하는 영상 행렬에서 모든 선을 제거합니다.
         4. 세분화를 위해 루트 및 토양 ROI를 하나의 전경(루트) 및 하나의 배경(토양) 매트릭스로 융합합니다.
         5. 루트 전경과 토양 배경을 가장 잘 분리할 수 있는 스펙트럼 대역(단일 스펙트럼 또는 스펙트럼 비율의 강도) 검색²⁷. Bhattacharyya distance^{28을 사용하여 뿌리와 토양에 대한 결과 픽셀 히스토그램 간의 차이를 정량화합니다}.
         6. 히스토그램을 구분하는 임계값 명암 값을 선택합니다.
         7. 선택한 임계값을 원본 이미지에 적용하여 이진 이미지를 만듭니다. 이렇게 하면 임계값보다 강도가 작은 모든 픽셀을 0으로 설정하고 강도가 높은 픽셀을 1로 설정합니다(자동으로 스크립트가 수행됨).
         8. 이진 이미지를 tiff 파일로 저장합니다.
      4. 이진 영상을 열고 루트 트레이트를 분석합니다. Root & Background Distinction(루트 및 배경 구분) 메뉴에서 (i) Based on grey levels(회색 레벨 기준) 및 (ii) Pale Root on Black Background(검정 배경에 페일 루트)를 선택하고 전역 강도 임계값을 사용합니다(이미지는 이미 이진화되어 있습니다).
      5. 초분광 데이터에서 수분 함량을 매핑하기 위해 보정 데이터셋을 획득하고 보정 방정식을 리조박스 이미지에 적용합니다.
         폴리스티렌 시트를 사용하여 rhizobox를 5cm 구획으로 세분화하여 물 함량이 다른 토양(실험에 사용된 것과 동일한 기판 및 db)으로 채웁니다(그림 8).
      6. 토양과 혼합할 물의 각각의 양을 계산하고 구획을 채웁니다(전체 뿌리 상자에 대해 1.3.에 설명된 것과 동일한 절차).
      7. 심어진 rhizobox에 사용된 것과 동일한 설정으로 보정 rhizobox를 스캔합니다.
      8. 스크립트를 사용하여 다음 단계를 수행합니다.
         1. 물 보정 상자에서 한 보폭으로 보폭의 네 부분을 병합하고 어두운 색과 흰색 표준으로 정규화합니다.
         2. 수분 함량이 다른 각 구획에서 직사각형 상자를 선택하고 구조 배열에 저장합니다.
         3. 수분 함량 구획을 가장 잘 분리하는 스펙트럼 특징을 결정합니다. 이것은 인접한 물 함량의 평균 스펙트럼 간의 강도 차이의 전역 최대값에 대한 검색 알고리즘으로 수행됩니다.
         4. calibration rhizobox의 각 수분 함량 compartment에 대해 이 기능에 대한 평균 스펙트럼 강도 값을 계산합니다.
         5. 직접 측정된 수분 함량과 해당 스펙트럼 수량자를 통해 회귀 방정식을 맞춥니다.
         6. 리조박스 영상에서 루트로 분류되지 않은 각 픽셀과 수분 함량과 가장 관련이 있는 위에서 결정된 스펙트럼 특징(대역)에 회귀 방정식을 적용합니다.

그림 5: 초분광 루트 스캐너.
스캐너의 주요 구성 요소가 표시되어 있습니다. 작은 그림은 리조박스를 이미징하는 동안 카메라를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 초분광 루트 이미징의 단계.
초분광 루트 이미징은 (i) 이미지 획득, (ii) 이미지 분할 및 (iii) 스펙트럼 데이터 분석의 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 수분 교정을 위한 Rhizobox.
rhizobox에는 폴리스티렌 시트로 세분화되는 다양한 수분 함량의 기판이 있는 구획이 포함되어 있습니다. 건조 구획의 발아 용지는 토양 입자가 이웃 구획으로 헹구지 않도록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 적용 사례

참고: 정량적 뿌리 정보는 식물 표현형(품종 비교)의 맥락에서 및 식물 생리학적 연구에 적용됩니다. 이러한 경우를 예시하기 위해 다음 지상 데이터가 보고되었습니다.

1. 잎 면적: 잎의 길이와 너비를 대리물로 사용하여 실험 중 선택한 단계에서 잎 면적을 비파괴적으로 측정합니다. 또는 캐노피 이미지를 사용할 수 있습니다²⁹.
   1. 실험이 끝나면 잎 면적 측정기를 사용하여 잘린 잎의 면적과 함께 잎의 길이와 너비를 측정합니다. 비파괴 방법을 보정하여 회귀 방정식을 데이터 쌍에 적용합니다.
2. 건조 물질 : 실험이 끝나면 가위로 식물을 잘라 지상 건조 물질을 측정하고 오븐에서 105 ° C에서 24 시간 동안 건조시킵니다.
3. 기공 전도도: 잎 포로미터로 기공 전도도를 측정합니다. 측정하기 전에 센서가 주변 조건과 평형을 이룰 수 있도록 장치를 기후 챔버에 최소 1시간 동안 보관하고 기후 챔버의 주변 설정이 변경될 때마다 장치를 보정하십시오. 식물당 최소 3개의 잎에서 치수를 측정합니다.

Results

RGB 및 HS 이미징을 기반으로 한 루트 분할에 대한 예제 결과가 제공됩니다. 분광 이미징을 위해 고해상도 물 매핑의 예가 제공됩니다. 마지막으로, 이미지 기반 루트 데이터가 적용되는 과학적 맥락을 보여주는 결과가 표시됩니다.

RGB 기반 루트 측정

그림 8은 사탕무 품종 Ferrara의 RGB 루트 이미지 시계열을 보여줍니다. 이미지는 리조박스의 불균일한 조명으로 인한 일부 인공물을 보여주며, 왼쪽을 따라 더 밝은 영역과 상단 이미지와 하단 이미지 사이의 겹치는 영역에서 다른 밝기를 보입니다.

그림 8: RGB 이미징의 루트 성장 시계열.
사진은 파종 후 다른 날의 사탕무 품종 Ferrara (DAS)를 보여줍니다. 이미지는 이미지의 왼쪽과 상단 및 하단 이미지 사이의 비균일한 조명으로 인한 일부 아티팩트를 보여줍니다. 눈금 막대, 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9는 파종 후 날(DAS) 35에서 품종 Ferrara의 색상 임계값을 기반으로 한 뿌리 분할에 대한 세부 정보를 제공합니다. 참조로(그림 9A) 이진 이미지가 사용되었으며, 여기서 모든 루트는 그래픽 태블릿으로 수동으로 추적되었습니다. 완전히 개발된 조밀한 사탕무 뿌리 시스템 전체를 수동으로 추적하는 데 필요한 시간은 약 4시간이었습니다. 그림 9B는 오래된 측면 뿌리가 있는 이미지 상단의 선택된 영역에 대한 자세한 보기를 제공합니다. 여기서 여러 루트 축은 색상 임계값에 따라 분류되지 않습니다. 반대로 흰색 어린 뿌리가 우세한 하단(그림 9C)에서는 색상 기반 분할이 모든 근 축을 적절하게 분류합니다. 이진화된 루트 시스템(그림 9D)은 정량 분석을 실행하기 전에 제외 영역으로 정의된 조명 아티팩트의 왼쪽에 검은색 영역을 보여줍니다. 그림 9E는 DAS 35에서 Ferrara의 RGB 이미지의 빨간색 채널에 대해 선택한 특징(뿌리 대 토양)의 해당 픽셀 히스토그램을 보여줍니다. 루트 픽셀(파란색)은 밝은 젊은 측면, 어두운 오래된 측면 및 탭 루트에 해당하는 세 개의 피크를 명확하게 보여줍니다. 오래된 측면과 토양 배경 사이의 겹침은 매우 강하여 분류되지 않은 뿌리 축으로 이어집니다(그림 9B 참조).

그림 9: 색상 임계값을 사용한 루트 분할.
(A) 그래픽 태블릿을 사용하여 수동으로 분할된 루트 시스템, (B) 상단에 잘못 분할된 오래된 루트 축이 있는 영역, (C) 이미지 하단에 적절하게 분할된 젊은 축, (D) 색상 기반 임계값에서 얻은 이진 이미지. (E) RGB 이미지의 선택된 특징에 대한 픽셀 히스토그램. 뿌리는 다른 뿌리 유형이 표시된 파란색 막대로 표시됩니다. 토양은 빨간색 막대로 표시됩니다. A와 D의 눈금대, 2cm; B와 C의 눈금 막대, 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

수동으로 분할된 참조 이미지에 대해 정량화된 결과 총 가시 루트 길이는 1534.1cm인 반면, 자동화된 색상 기반 분할은 총 루트 길이를 1427.6cm로 제공합니다.

UV 조명의 그레이스케일 이미지는 여기에 표시된 경우에 이점을 제공하지 않으며 색상 임계값(루트 길이: 1679.7cm)에 비해 성능이 떨어집니다. 오래된 뿌리는 분할할 수 없었고, 이미지에 노이즈가 더 많았는데, 아마도 UV 램프의 낮은 광도 때문일 것입니다. 그러나 자동 형광이 높고 밝은 배경 기판을 가진 어린 뿌리의 경우 모래를 배경 기판으로 사용한 다른 실험에서 얻은 이미지에서 볼 수 있듯이 UV 조명은 여전히 옵션이 될 수 있습니다(그림 10).

그림 10: 밝은 배경에서 뿌리를 시각화하기 위한 UV 조명.
석영 모래로 채워진 뿌리 상자에서 자라는 듀럼 밀 뿌리 시스템의 예. 리조박스는 (A) 자외선 및 (B) 형광(주간) 조명으로 이미지화됩니다. 눈금 막대, 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

HSI 기반 루트 측정

그림 11은 3개의 루트 ROI(이전 및 젊은 측면, 탭 루트)와 2개의 토양 ROI(리조박스의 상단 및 하단)에 대한 평균 스펙트럼을 제공합니다.

그림 11: 뿌리와 토양의 평균 스펙트럼.
뿌리(3가지 뿌리 유형)와 토양(뿌리 상자의 상단 및 하단)에 있는 관심 영역(ROI)의 스펙트럼. ROI는 뿌리와 토양 사이의 최적 세분화 기준을 결정하기 위해 선택됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

탭과 젊은 측근은 대부분의 스펙트럼 대역의 강도가 배경과 상당히 다르다는 것이 분명합니다. 오래된 측면의 경우 강도 차이가 훨씬 낮습니다. 시각적으로 추론할 수 있는 특징은 수분 흡수 영역(1450nm) 주변 스펙트럼의 다른 기울기입니다. 여기서 뿌리 스펙트럼의 기울기는 토양 스펙트럼에 비해 높습니다. 또한, 약 1100nm 영역에서 탭 및 젊은 측면 스펙트럼의 변화를 확인할 수 있으며, 이는 이전 측면에서는 발생하지 않습니다.

그림 12A는 전경-배경 대비가 가장 강한 스펙트럼 비율을 식별하는 검색 알고리즘의 결과를 보여줍니다. 1476 nm와 1076 nm에서의 스펙트럼 비율은 뿌리와 토양을 가장 잘 분리합니다. 루트 전경 및 토양 배경 픽셀의 결과 히스토그램은 그림 12B에 나와 있습니다. 일부 겹치는 부분이 있지만 대부분의 픽셀은 토양 배경과 명확하게 분리되어 있습니다. 히스토그램을 통해 바이모달 가우스 곡선을 피팅하고 정량화를 위해 Bhattacharyya 거리를 사용하면 값 7.80을 얻을 수 있습니다. 값이 3.0보다 크면 이미지 대비가 강하여 신뢰할 수 있는 분리를 허용함을 나타냅니다²⁸.

그림 12: 서로 다른 스펙트럼 대역 비율에 대한 뿌리 전경과 토양 배경 간의 반사율 차이와 분할에 사용된 스펙트럼 비율에서의 픽셀 히스토그램.
(A) 밝은 색상(노란색)은 전경과 배경 사이의 높은 대비를 나타내고 어두운 색상(파란색)은 낮은 대비를 나타냅니다. 처음 15개 밴드는 노이즈 때문에 제거되었습니다. 빨간색 선은 대비가 가장 높은 밴드 비율을 나타냅니다. (B) 분할 스펙트럼 비율에서 뿌리(파란색)와 토양(빨간색)의 픽셀 히스토그램. 파란색 막대는 뿌리를 나타내고 빨간색 막대는 토양을 나타냅니다. 강도 값은 스펙트럼 대역 160과 스펙트럼 대역 49의 비율에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이진 이미지(그림 13)는 히스토그램 distance^{27에서 계산된 값 1.008에서 식별된 스펙트럼 비율의 전역 강도 임계값을 적용하여 생성됩니다}. 이 이미지의 뿌리 길이를 분석한 결과 총 길이가 1557.3cm로 표시되며, 이는 수동으로 추적된 참조 이미지에 비해 1.5%의 오류에 불과합니다.

그림 13: 사탕무 품종 Ferrara의 뿌리 시스템의 이진 이미지.
이미지는 전역 스펙트럼 임계값을 적용하여 얻습니다. 눈금 막대 (왼쪽 하단 모서리), 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

색상 기반 정보에 비해 스펙트럼 정보를 사용하여 루트 분할이 개선되었지만 HS 이미징의 주요 목적은 화학 측정 이미지 특성을 분석하는 것입니다. 이것은 rhizobox 이미지의 수분 함량을 매핑하여 예시됩니다.

그림 14A는 수분 함량이 다른 토양으로 채워진 교정 rhizobox(cf. 그림 7)에 있는 구획의 평균 스펙트럼을 보여줍니다. 스펙트럼의 모양은 구획 간에 유사하며, 즉, 여기서 스펙트럼 비율이 반드시 더 안정적인 분류 기준을 제공하는 것은 아닙니다. 따라서 인접한 물 함량 간의 평균 차이가 최대화되는 단일 스펙트럼 대역(1680nm)에서의 강도가 최상의 분리 기준으로 식별됩니다. 이 스펙트럼 파장에 대한 결과 픽셀 히스토그램은 그림 14B에 나와 있습니다.

그림 14: 수분 함량 보정을 위한 스펙트럼 기능.
(A) 물 함량이 다른 교정 rhizobox에서 9개의 물 구획의 평균 스펙트럼; (B) 인접 구획 사이의 평균 거리가 최대인 대역 216의 물 구획에 대한 픽셀 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1680nm에서 평균 픽셀 강도와 측정된 수분 함량의 관계는 그림 15.

그림 15: 스펙트럼 반사율과 체적 수분 함량의 관계.
이 그림은 측정된 수분 함량과 스펙트럼 반사율의 데이터 쌍을 가장 높은 수분 함량(빨간색 삼각형)을 제외한 데이터에 맞는 경험적 곡선(선형 및 지수)과 함께 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

더 높은 수분 함량과 스펙트럼 강도를 구별하는 것이 어려워집니다. R2가 높은 유의미한 회귀(선형 또는 지수)는 최대 약 0.30cm^3cm-3의 수분 함량에 적합할 수 있습니다. 습한 토양 조건은 강도 값으로 안정적으로 예측할 수 없습니다. 물 함량이 0.30cm ^3cm-3 높을수록 반응이 감소하면서 반사율과 수분 함량 사이의 기하급수적 관계의 유사한 동작이 다른 연구에서도 발견되었습니다³⁰.

수분 함량의 미세 매핑이 있는 rhizobox 이미지는 그림 16. 네 가지 측면에 주목해야 합니다. 첫째, 수분 함량이 낮은 영역이 뿌리 줄기의 뿌리 부분에서 볼 수 있습니다. 둘째, 가장 강한 고갈은 단일 루트 축 부근에 집중되어 있습니다. 셋째, 고갈 지역은 표면에 뿌리 축이 보이지 않는 곳에서도 발생하며, 이는 뿌리가 토양에 숨겨진 영역을 나타냅니다. 넷째, 추가 이미지 처리 없이 물 매핑을 하면 응집된 토양으로 인해 고르지 못한 모양이 나타납니다. 이는 골재 규모에서 불균일한 수분 함량 분포를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 이미지 품질에 대한 표면 형태 효과를 나타낼 수도 있습니다. 화학 측정 이미지 처리 기술은 스펙트럼 이미지에서 이러한 형태학적 효과를 극복하기 위한 옵션이지만³¹이지만 여기에 사용된 Matlab 스크립트에서는 지금까지 구현되지 않았습니다.

그림 16: 리조박스의 수분 함량 매핑.
짙은 파란색은 수분 함량이 높은 지역을 나타내고 녹색에서 빨간색 영역은 수분 함량이 낮은 지역을 나타냅니다. 식물 뿌리는 이미지에 검은 색으로 오버레이됩니다. 눈금 막대 (왼쪽 하단 모서리), 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

응용 프로그램 예제

그림 17은 지상 측정과 이미지 분석의 정량적 근 특성을 관련시킵니다.

그림 17: 루트 데이터에 대한 일반적인 응용 프로그램 예제.
(A) 및 (B)는 표현형 맥락에서 지상-지하 식물 특성화에 사용되는 뿌리 정보를 보여줍니다. (A)는 사탕무 품종 Ferrara의 뿌리 성장을 나타내고, (B)는 잎과 뿌리 면적 비율(1번의 반복에서 얻은 데이터)을 사용하여 6개의 뿌리 줄기 재배 사탕무 품종을 비교합니다. (C)와 (D)는 식물의 생리학 연구에서 발견되는 형질 간의 기능적 관계입니다. (C)는 건조 물질 생산에 대한 잎 대 뿌리 면적 비율의 영향과 (D) 뿌리 표면적과 기공 전도도의 관계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 17A 및 17B는 포괄적인 지상 및 지하 식물 특성화에 초점을 맞춘 표현형과 관련이 있습니다. 그림 17A는 사탕무 품종 Ferrara의 뿌리 성장을 보여줍니다(<strong class="xfig" 참조>이미지는 그림 8). 뿌리 시스템의 확장은 식생 기간의 주어진 시간 동안 토양 부피를 탐사할 수 있는 품종의 능력을 나타냅니다. 그림 17B는 6가지 사탕무 품종의 잎과 뿌리 표면적 비율을 보여주며, 식물 공급(뿌리)과 수요(잎) 사이의 균형에 대한 설명자를 제공합니다.

그림 17C와 17D는 생리학적 연구에서 관심의 기능적 관계에 대한 예를 제공합니다. 에서 그림 17C 잎 대 뿌리 표면적 비율은 실험 중에 형성된 건조 물질과 관련이 있으며, 이는 건조 물질 축적을 제한하는 요인으로서 동화 표면의 우세한 역할을 나타냅니다. 비교적 높은^R2에도 불구하고 유의성이 부족한 것은 여기에 사용된 쌍을 이루는 데이터(n=6)의 수가 적다는 것과 관련이 있습니다. 그림 17D는 뿌리 표면적이 더 높은(흡수 개선) 품종이 실험 과정에서 평균적으로 더 높은 기공 전도도를 갖는다는 것을 보여줍니다. 뿌리 면적이 높을수록 물 추출이 지속되어 기공 개방이 연장되는 것 같습니다.

Discussion

프로토콜 루트 시스템 이미징 성장 하는 토양에 대 한 두 개의 상호 보완적인 접근을 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 실험 결과 대 한 중요 한 단계는 관측 창에 꽉 루트-토양 접촉을 제공 하 고 공기 간격을 방지 하는 전면 유리에도 동종 기판 레이어를 보장 하는 rhizoboxes의 작성 이다. 이것의 비교적 좋은 체질된 흙을 사용 하는 주요 이유는 < 2: 골 재 사이의 공 극으로 관찰 창에서 더 높은 표면 형태에 더 큰 집계 결과. 루트 팁 탈수의 위험이 높은, 외이 물 매핑³¹에 대 한 더 복잡 한 이미지 처리 기법을 필요합니다.

프로토콜의 수정 따라서 rhizoboxes의 향상 및 빠른 작성에 초점을. 현재 시간을 작성 하는 것은 상자 당 약 30 분입니다. 또한 측 및 더 나은 RGB 이미지에 대 한 조명 동질성을 최적화 하기 위해 수정에서 영상에 대 한 두 개의 유리창와 rhizoboxes의 사용은 테스트. 추가 하드웨어 확장 또한 평면 optodes³² rhizobox 시스템으로³³ 이미징 커패시턴스의 통합을 좋습니다. 그러나 이것이 현재 업그레이드 활동 넘어입니다.

소프트웨어 수정 퓨즈 상단 및 하단 RBG 이미지³⁴자동 이미지 등록에 초점. Hyperspectral에 대 한 이미징 고급 자동된 기능 추출 SVMs³⁵ 테스트와 같은 더 민감한 감독된 대상 탐지 방법으로²⁸ 접근 한다. 그로 인하여 hyperspectral 데이터는 잠재적으로 여러 토양, rhizosphere 및 루트 속성³⁶의 평가 대 한 허용. 개발 (세미)는 것 또한 건축 특성 (분기 주파수, 각 분기) 뿐만 아니라 rhizobox 루트에 따라 이미지 루트 시스템 분석기³⁷ 형태학 계량의 수정된 된 버전 (길이, 직경, 표면)에 대 한 소프트웨어 automatized.

3D 이미징 접근에 비해 프로토콜의 주요 제한은 표면 표시 루트 및 rhizosphere 속성 제한입니다. 그러나 그것은 보이는 루트 특성 전체 루트 시스템²¹에 대 한 신뢰할 수 있는 프록시는 증명 되었습니다. Rhizobox 기술은 전통적인 파괴적인 샘플링 (세척) 동적 성장 전체 루트 시스템 특성 대 표시의 관계를 확인 하려면 이미징의 끝에와 쉽게 결합 된다. 이 관계는 종²¹중 다 수, 파괴적인 샘플링 다른 작물 종으로 어떤 새로운 형질 시리즈에 대 한 표시 특성에서 신뢰할 수 있는 유추 되도록 것이 좋습니다.

여기에 제시 된 프로토콜의 주요 장점은 현실적인 성장 조건 (토양), 일시적으로 해결 RGB 이미지와 루트 기능 (예: 물 통풍 관) hyperspectral 화상 진 찰에서 chemometric 및 rhizosphere 데이터를 통해 유추에 대 한 상대적으로 높은 잠재적인 처리량의 조합입니다. 그로 인하여 방법 유추 제한 높은 처리량 경종 및 비-토양 루트 방법¹⁴, 그것은 부분적으로 덜 실험적인 복잡성과 고급 3D 방법¹⁵에 비해 높은 처리량으로 업무 프로세스에 대 한 깊은 형질 통찰력을 허용 하는 동안 이미지를 극복 한다.

곧 실험 프로토콜 mycorrhiza 루트 시스템 개발 및 토양 구조, 질소 및 탄소 관련 된 덮개 작물 종의 형질 루트 특성에 관해서는 뿐만 아니라 콩의 기능에의 효과 연구 하는 데 사용 됩니다 사이클링.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rhizobox	Technisches Bü ro fü r Bodenkultur	실험용 빌더
LED 램프 ATUM HORTI 600	Klutronic	AHI10600F
형광등 튜브 HiLite T5 Day	Juwel Aquarium	86324
UV 광 튜브 Eurolite 45cm 슬림 15 W	Conrad	593384 - 62
Canon EOS 6D	Canon Austria GmbH	8035B024
Adobe Photoshop CS5 확장 버전 12.0 x 32	어도비 시스템즈 소프트웨어 아일랜드 Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013	리젠트 인스트루먼트 Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR 카메라	Xenics	XEN-000105
분광기 Imspector N25E	Specim
초분광 이미징 스캐너	Carinthian Tech Research AG	실험적 빌더	초분광 이미징 스캐너 및 소프트웨어
Matlab R2106a	Mathworks		의 설계 및 조립이미지 처리, 신호 처리 및 통계 및 기계 학습용 도구 상자 포함
AP4, Poromoeter	Delta-T-Devices
LI-3100C, 면적 측정기,	LI-COR
BASF, 스티라뒤르, 폴리스티렌 시트	, Obi, Baumarkt	9706318	다양한 유형의 폴리스티렌 시트 또는 수분이 다른 토양을 분리하는 기타 재료를 사용할 수 있습니다