In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model
Summary
Målet med denne protokol er at give mulighed for detektion af in vivo antigen-specifikke drab af en målcelle i en murine model.
Abstract
Nuværende metoder til antigen-specifikke drab er begrænset til in vitro- brug eller udnyttet i infektionssygdom modeller. Der er imidlertid ikke en protokol, der er specielt beregnet til at måle antigen-specifikke drab uden en infektion. Denne protokol er designet og beskriver metoder til at overvinde disse begrænsninger ved at tillade til påvisning af antigen-specifikke drab af en målcelle ved CD8+ T-celler i vivo. Dette opnås ved at flette en vaccination model med en traditionel CFSE-mærket målet dræbe assay. Denne kombination gør det muligt for forskeren at vurdere antigen-specifikke CTL potentiale direkte og hurtigt som analysen ikke er afhængig af tumorvækst eller infektion. Derudover udlæsningen er baseret på flowcytometri og så skal være let tilgængelige for de fleste forskere. De store begrænsning af undersøgelsen er at identificere den tidslinjen i vivo , der passer til den hypotese at være testet. Variationer i antigen styrke og mutationer i T-celler, der kan resultere i differential cytolytisk funktion skal vurderes omhyggeligt for at fastslå det optimale tidspunkt for celle høst og vurdering. Den passende koncentration af peptid for vaccination er blevet optimeret til hgp10025-33 og æg257-264, men yderligere validering vil være behov for andre peptider, der kan være mere hensigtsmæssigt at en given undersøgelse. Samlet set denne protokol giver mulighed for en hurtig vurdering af dræbe funktion i vivo og kan tilpasses til enhver given antigen.
Introduction
Flere protokoller findes til at vurdere cytolytisk (CTL) af en CD8+ eller CD4+ T-celle. Denne vurdering kan let gøres i vitro under kontrollerede forhold1,2,3. Derudover infektionssygdom modeller, såsom LCMV, klassisk har undersøgt CTL funktion ved hjælp af varierende CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester) mærket målceller hvor CFSEHej-mærket celler er pulserende med en peptid og CFSElo-mærket målet celler er tilbage unpulsed. Cellerne er derefter sprøjtes i forholdet 1:1 og vurderet for tabet af CFSEHej-mærket pulserende mål af flow flowcytometri4. Vaccine og afvisning modeller har også brugt lignende strategier til vurdering af, i vivo drab af begge CD8+ og CD4+ T-celler såvel som NK celler5,6. Dette er en kraftfuld assay, men kræver brug af smitstoffer, der prime immunsystemet inden målet injektionen.
Denne protokol, på den anden side kræver ingen forudgående infektion af værten og i stedet udnytter en vaccinationsstrategi for at prime immunsystemet inden målet injektionen. Denne vaccination består af en vand-baseret formulering af peptid vaccine, som kræver tilvejebringelse af en immunstimulerende cocktail kaldet covax7, bestående af en Toll-lignende receptor 7 (TLR7) agonist (imiquimod creme), en agonistisk anti-CD40 antistof, og interleukin-2 (IL-2) fører til synergistisk kombination af immunstimulerende agenter for udvikling af peptid-specifikke priming og robust immunrespons. Som sådan, giver denne analyse en hurtig udlæsning af listen over Tillidscertifikater funktion som vaccinen er indgive sammen med celler for vurdering af funktion kun tre dage før injektion af target-cellerne. Derudover er covax priming stærke nok, at drab kapacitet af PRIMES antigen-specifikke T-celle kan ses mellem 4 og 24 timer efter injektion.
De store begrænsning af denne protokol er at identificere tidslinjen i vivo til påvisning af target drab, der er egnet til både antigenet og den hypotese at være testet. Omhyggelig vurdering skal udføres, som variationer i antigen styrke samt genetiske ændringer bliver testet i T-celler kan resultere i differential CTL-funktion, som ville kræve en forskellig timing påvisning af target drab. Hertil kommer, mens den passende koncentration af peptid for vaccination er blevet optimeret til menneskelige melanom antigen glycopeptidgruppen 100 (hgp10025-33) og ægalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , brug af en anden antigen model, der kan være mere hensigtsmæssigt at en given undersøgelse ville kræve yderligere validering. På grund af forventede forskelle i en mål antigener evne til at stimulere CTL effektor funktion i kombination med covax som en adjuvant, kan optimering af IL-2 dosis koncentration og dosis frekvens være afgørende for at nå de ønskede mål. Samlet set denne protokol giver mulighed for en hurtig vurdering af dræbe funktion i vivo og kan tilpasses til enhver given antigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er ligetil, er der et par kritiske trin, der skal udføres omhyggeligt. Covax priming efter injektion af antigen-specifikke T-celle bliver testet er nødvendige for at se alle drab på de pulserende mål. Mens det er muligt at vandbaseret covax vaccination skaber en akut inflammatorisk tilstand, for de kronisk inflammatoriske fase, kan erstatter den kortlivede vand-baseret formulering med en langsom-antigen release olie-baserede tilgang producere en bedre resultat7,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af NIH forskning (A1R03AI120027 (RN) og 1R21AI20012 (RN)), institutionelle forskning tilskud (RN), start-up tilskud (RN), og MD Anderson CIC frø yde (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
