Vi beskriver en metode til at måle aktivering af Fc-medieret effektor funktion af antistoffer der er rettet mod influenza virus hemagglutinin. Denne analyse kan også tilpasses for at vurdere monoklonale antistoffer eller polyklonale sera rettet mod andre virale overflade glykoproteiner evne til at fremkalde Fc-medieret immunitet.
Antistoffer spiller en afgørende rolle i at kombinere de medfødte og adaptive immunrespons mod viral patogener gennem deres antigen bindende domæner og Fc-regioner. Her, vi beskriver, hvordan at måle aktivering af Fc effektor funktion af monoklonale antistoffer rettet mod influenza virus hemagglutinin med brug af en genetisk manipuleret Jurkat cellelinje udtrykker en aktivering af type 1 Fc-FcγR. ved hjælp af denne metode, den bidrag af specifikke Fc-FcγR interaktioner tillagt immunoglobuliner kan bestemmes ved hjælp af en i vitro assay.
Immunitet, som den sæsonbestemte influenzavaccine er traditionelt blevet vurderet af den hemagglutination hæmning (HI) analyse1, hvilke måler tilstedeværelsen af antistoffer rettet mod webstedet receptor binding af hemagglutinin. Disse HI-aktive antistoffer kan overdrage sterilisering immunitet, men er generelt smalle i deres bredde af beskyttelse, giver immunitet til kun en udvalgt nogle stammer af influenzavirus. Isolering og karakterisering af bredt reaktive monoklonale antistoffer, der genkender hemagglutinin (HA) tyder på at udvikle en universal influenzavaccine er inden for rækkevidde2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. en af de vigtigste mål for en universal influenzavaccine er at fremkalde en stærk antistofrespons mod de bevarede dele af influenza virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. stort set reaktive antistoffer, der anerkender disse bevaret epitoper, består af både neutraliserende og ikke-neutraliserende antistoffer17,18, har vist sig at kræve Fc-FcγR interaktioner for optimal beskyttelse i vivo og Fremhæv bidrag af Fc-medieret immunitet over for influenza virus19,20samlede immunresponset.
Korrelerer beskyttelse er afgørende for vurderingen af immunitet over for infektion. Disse målinger giver mulighed for forskere og klinikere til at vurdere effekten af vacciner, betydningen af data og behandlingsforløbet. Den eneste etablerede korrelat af beskyttelse mod influenza virusinfektion er hemagglutination hæmning assay. En titer på 1:40 er forbundet med en 50% reduktion i risikoen for sygdom1,21 – og afspejler tilstedeværelsen af antistoffer, der hæmmer agglutination af målretning receptor bindende stedet ligger på den kugleformede hoved af HA. Det skal dog også bemærkes, at T-celle svar kan være en bedre korrelat af beskyttelse mod influenza virusinfektion hos ældre. Interessant nok, tyder en nylig rapport på, at neuraminidasetypen hæmning aktivitet kan være en bedre indikator for immunitet over for influenza22. Heldigvis, typisk in vitro- undersøgelser såsom neutralisering eller neuraminidase hæmning assays kan måle HA stilk – eller neuraminidase-specifikke antistoffer. De fleste af disse konventionelle in vitro- assays, imidlertid kun tages hensyn til funktionen af antigen bindende region af antistoffet og måler ikke rolle i regionen Fc. Derudover bidrag af ikke-neutraliserende antistoffer, som beskytter via Fc receptor engagement i vivo er ikke opdaget17,18. For at måle af antistoffer, der inducerer Fc-medieret immunitet som antistof afhængig celle medieret cytotoksicitet (ADCC) ydede beskyttelse, der er behov for en robust i vitro assay.
Metoden beskrevet nedenfor vurderer murine monoklonale antistoffer evne til at fremkalde Fc-medieret funktioner ved hjælp af en genetisk modificeret Jurkat cellelinje udtrykker en aktivering murine skrive 1 FK, FcγRIV. Antistof engagement af FcγR transduces intracellulær signalering at udløsere nukleare faktor af aktiverede T-celler-medieret luciferase aktivitet. Analysen har flere fordele frem for traditionelle teknikker, der kræver isolering og kultur af primære effektor celler og brugen af flowcytometri hen til opdager aktivisering af Fc-medieret effektor funktion19,23,24 ,25,26. Først kan protokollen beskrevet her nemt tilpasses til at optage forskellige viral mål, FcγRs og antistoffer fra forskellige arter (menneskelige og murine). Andet brugen af en modificeret Jurkat celle linje at udtrykke en FcγR med et luciferase reporter gen under en nuklear faktor af aktiverede T-celle (NFAT) giver mulighed for et stort format assay, der nemt kan analyseres ved hjælp af en Pladelæser måling luminescens. Her, erstattes den traditionelle aktivering af primære effektor celler med induktion af NFAT-luciferase ved antistof engagement i en FcγR på overfladen af cellen Jurkat. Denne 96-brønd plade format assay giver mulighed for måling af op til fire forskellige prøver i tre med syv fortyndinger – et antal stikprøver, der kunne være besværligt, ved hjælp af traditionelle teknikker. Der er yderligere punkter at overveje, med denne analyse, der kan påvirke design af eksperimenter og fortolkning af data. Viral målet skal udtrykkes på celleoverfladen i rækkefølge for antistof anerkendelse. For at afbøde dette, kan målet antigen (f.eks. en intern viral protein) belægges direkte på overfladen af en plade. Men dette ikke endnu er blevet grundigt testet. Derudover den modificerede Jurkat-cellelinie udtrykker kun én type af aktivering FcγR og udtrykker ikke nogen hæmmende FcγRs, mens primær cellelinjer udtrykke alle receptorer i en fysiologisk kontekst.
Vi har tidligere brugt dette assay for at demonstrere at epitopspecificitet et polyklonalt led spiller en afgørende rolle i reguleringen af Fc-medieret effektor funktion og at optimal aktivering af antistof-afhængige celle-medieret reaktion kræver to punkter i Kontakt27,28. Her, beskriver vi en metode, der vurderer evne til stilk-specifikke monoklonale antistoffer til at engagere sig og aktivere den murine aktivering FcγRIV. Selvom der er undtagelser29,30, et stort antal bredt reaktive antistoffer målrette hemagglutinin antigent bevarede stilk-regionen og dermed spille en vigtig rolle i udviklingen af en universel influenza vaccine.
Metoden beskrevet her tillader brugeren at måle en HA-specifikke monoklonale antistof evne til at engagere de murine FcγRIV. Target antigen, influenza virus hemagglutinin, udtrykkes på overfladen af celler efter infektion med virus eller Transfektion af plasmid DNA. Analysen er yderligere modtagelig hen til benytter forskellige overflade-udtrykt virale proteiner i kombination med andre FcγRs (mennesker eller murine). Derudover har vi brugt sera prøver for at vurdere antistoffer i forbindelse med polyklonale evne til…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har været finansieret delvist med føderale midler fra det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme, National Institutes of Health, Department of Health og Human Services, under CEIRS kontrakt P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |