कुशल पीढ़ी और फीडर का संपादन-CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग मानव अग्नाशय कोशिकाओं से मुक्त IPSCs
Summary
इस प्रोटोकॉल विस्तार से पदचिह्न-मुक्त प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) में मानव अग्नाशय कोशिकाओं से फीडर मुक्त शर्तों, CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins और संशोधित के लक्षण वर्णन का उपयोग कर संपादन द्वारा पीछा की पीढ़ी का वर्णन एकल सेल क्लोन ।
Abstract
भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाएं स्वयं को नवीनीकृत और शरीर के कई प्रकार के कोशिका में अंतर कर सकते हैं । pluripotent कोशिकाओं को इस प्रकार reअपक्षयी चिकित्सा में अनुसंधान के लिए प्रतिष्ठित हैं और नेत्र रोगों, मधुमेह, हृदय रोगों, और अन्य विकारों के लिए नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान में कर रहे हैं । CRISPR/कैस प्रणाली सहित जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों के साथ युग्मित विशेष कोशिका प्रकार में अंतर करने की क्षमता विभिंन अनुप्रयोगों के लिए iPSC के जीनोम सिलाई के लिए अतिरिक्त अवसर प्रदान की है रोग मॉडलिंग सहित, जीन थेरेपी, और भेदभाव के रास्ते पक्षपात, कुछ नाम है । उपलब्ध संपादन प्रौद्योगिकियों के अलावा, CRISPR/Cas9 से स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes साइट-युकेरियोटिक जीनोम के विशेष संपादन के लिए पसंद के एक उपकरण के रूप में उभरा है । CRISPRs आसानी से सुलभ हैं, सस्ती, और अत्यधिक कुशल इंजीनियरिंग लक्षित संपादन में । प्रणाली एक Cas9 nuclease और एक गाइड अनुक्रम की आवश्यकता है (20-मेर) जीनोमिक लक्ष्य के लिए विशिष्ट abutting एक 3-न्यूक्लियोटाइड “NGG” protospacer-संनिकट-आकृति (पाम) Cas9 को लक्षित करने के लिए वांछित जीनोमिक लोकस के साथ, एक सार्वभौमिक Cas9 बाध्यकारी अनुरेखक आरएनए के साथ ( एक साथ एक गाइड आरएनए या sgRNA कहा जाता है) । यहाँ हम फीडर की कुशल पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल-स्वतंत्र और पदचिह्न-मुक्त iPSC और Cas9 ribonucleoprotein (RNP) परिसरों का उपयोग iPSC के जीनोम संपादन के लिए तरीके का वर्णन प्रस्तुत करते हैं । जीनोम संपादन प्रोटोकॉल प्रभावी है और आसानी से Cas9 प्रोटीन के साथ एक से अधिक लक्ष्य के लिए पूर्व जटिल sgRNAs द्वारा और एक साथ कोशिकाओं में पहुंचाने के लिए मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है । अंत में, हम वांछित संपादन के साथ iPSCs की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण का वर्णन । एक साथ लिया, रेखांकित रणनीतियों के लिए कई गुना अनुप्रयोगों के लिए iPSC की पीढ़ी और संपादन को कारगर बनाने की उंमीद कर रहे हैं ।
Introduction
reprogramming कारकों के व्यक्त द्वारा pluripotent राज्य के लिए मानव दैहिक कोशिकाओं के reprogramming रोग मॉडलिंग, अपक्षयी चिकित्सा, और नशीली दवाओं के विकास में आवेदन के साथ स्टेम सेल अनुसंधान में क्रांति ला दिया है । कई गैर वायरल reprogramming तरीकों reprogramming कारकों और सृजन iPSCs के वितरण के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन प्रक्रिया गहन श्रम है और नहीं बहुत कुशल1। वायरल तरीकों, हालांकि कुशल, वायरस एकीकरण और tumorigenicity2,3,4की समस्याओं के साथ जुड़े रहे हैं । इस पांडुलिपि में, हम reprogramming कारकों को वितरित करने और पदचिह्न-मुक्त iPSC लाइनों की स्थापना के लिए cytoplasmic सेंडाइ वायरस के उपयोग की रिपोर्ट है कि उनके जीनोम5में किसी भी वायरल वेक्टर दृश्यों के एकीकरण की कमी है । सेंडाइ वायरस एक आरएनए वायरस है कि सेल कोशिका के बाहर पतला है ~ संक्रमण के बाद 10 मार्ग और बहुतायत में reprogramming कारकों का उत्पादन, तेजी से और कुशल reprogramming6,7के लिए अग्रणी । स्थापित iPSCs तो आसानी से फीडर मुक्त माध्यम से संक्रमण हो सकता है फीडर कोशिकाओं8के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के उपयोग से बचने के लिए ।
इस प्रकाशन में, सेंडाइ वायरस मध्यस्थता reprogramming के अलावा, हम भी संपादन iPSCs, जो अनुसंधान के लिए वांछित आनुवंशिक संशोधनों के साथ असीमित मानव कोशिकाओं की आपूर्ति करने की क्षमता है के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन । हम iPSCs के संशोधन के लिए CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया है, जो अब दस्तक सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है ins और नॉकआउट, बड़े पैमाने पर जीनोमिक विलोपन, जीन डिस्कवरी के लिए परित पुस्तकालय स्क्रीनिंग, आनुवंशिक इंजीनियरिंग की कई मॉडल जीवों, और जीन थेरेपी9,10,11. इस तकनीक में स्ट्रेप्टोकोकस pyogenesके परिसरों का गठन शामिल है-व्युत्पंन Cas9 nuclease और 20-मेर गाइड RNAs है कि आधार के माध्यम से लक्ष्य मांयता प्राप्त-जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम से सटे 3 ‘ न्यूक्लियोटाइड protospacer आसंन के साथ बांधना आकृति (पाम) अनुक्रम । Cas9 nuclease एक डबल असहाय तोड़ लाती है ~ पाम साइट है, जो बाद में गैर द्वारा मुख्य रूप से मरंमत मुताबिक़ अंत में शामिल होने से 3 न्यूक्लियोटाइड (NHEJ) मार्ग सम्मिलन या खुले पढ़ने के फ्रेम में हटाने के लिए अग्रणी, और इस तरह कार्यात्मक 12जीन के नॉकआउट ।
हमारे सुधार प्रोटोकॉल मानव अग्नाशय कोशिकाओं की संस्कृति के लिए विवरण, mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) पर उनके reprogramming के लिए reprogramming के उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए, फीडर मुक्त संस्कृति के बाद अनुकूलन शामिल Matrigel पर, स्थापित iPSCs के लक्षण वर्णन, CRISPR निर्देशित आरएनए डिजाइन और तैयारी, RNP परिसरों के रूप में iPSCs में प्रसव, एकल कोशिका संपादित iPSCs की क्लोनिंग लाइनों उत्पन्न करने के लिए छंटाई, आसान स्क्रीनिंग और संपादन की पहचान, और के लक्षण वर्णन एकल सेल क्लोन । जीनोमिक हटाए गए Cas9 प्रोटीन और दो CRISPR sgRNA RNP परिसरों की शुरूआत से इस अध्ययन में कुशलतापूर्वक उत्पंन किया गया डबल असहाय टूटता (DSBs) और हस्तक्षेप खंड को हटाने के लिए प्रेरित । इस विधि को खुले पढ़ने के फ्रेम में विलोपन पैदा करने के लिए दो गाइड के उपयोग पर कैपिटल, NHEJ की उच्च दक्षता क्लोन की जरूरत है कि कम संख्या के लिए अग्रणी है, और स्वचालित केशिका द्वारा क्लोन के आसान प्रारंभिक स्क्रीनिंग ट्रो इकाई, अंश विश्लेषक । मानव स्टेम सेल आधारित रोग मॉडल उत्पंन करने के लिए इन प्रभावी जीनोम संपादन तरीकों को जल्द ही किसी भी स्टेम सेल प्रयोगशाला में एक मानक और नियमित दृष्टिकोण बन जाएगा । अंत में, सटीक जीनोम संपादन यह स्टेम सेल रोग मॉडलिंग से परे जाना संभव कर देगा और संभावित उत्प्रेरित सेल आधारित चिकित्सा मदद कर सकता है ।
Protocol
1. reprogramming प्रोटोकॉल पीढ़ी मानव iPSC प्राथमिक मानव अग्नाशय कोशिकाओं से कोट एक 6-अच्छी तरह से थाली के साथ १.५ मिलीग्राम/एमएल ठंडा कोलेजन और यह ३७ पर जेल के लिए अनुमति दें & #176; ग के लिए 1 ज. प?…
Representative Results
Discussion
iPSCs के लिए मानव दैहिक कोशिकाओं की reprogramming बुनियादी जीव विज्ञान अनुसंधान, व्यक्तिगत चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, दवा विकास और अपक्षयी चिकित्सा के क्षेत्र के लिए एक प्रमुख बढ़ावा प्रदान की है16। मानव iPSC पी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लैब में काम डॉ अंजलि नंदी को postdoctoral फैलोशिप अनुदान, और मैरीलैंड स्टेम सेल रिसर्च फंड से बीटी (TEDCO) के लिए खोजपूर्ण अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
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