効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集
Summary
これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代を詳細単一細胞のクローンを作成します。
Abstract
胚性人工多能性幹細胞は自己更新でき、体の種類の細胞に分化します。多能性細胞は再生医療の研究のためこのように切望され、眼疾患、糖尿病、心臓病や他の疾患の臨床試験は、現在。ゲノム編集 CRISPR/Cas システムを含む技術の最近の進歩と相まって種類の専門にされた細胞に区別するために潜在的な様々 なアプリケーションの iPSC のゲノムを仕立ての追加の機会を提供しています。疾患モデル、遺伝子治療を含む、いくつかの名前への分化の経路をバイアスします。利用可能な編集技術の中で化膿連鎖球菌から CRISPR/Cas9 は、真核生物のゲノムのサイト固有の編集に最適なツールとして浮上しています。CRISPRs は、簡単にアクセスでき、安価で、ターゲットを絞った編集工学で非常に効率的です。Cas9 ヌクレアーゼとガイド シーケンス (20 mer) の 3 塩基”NGG”protospacer-隣接する-モチーフ (PAM) 普遍的な Cas9 バインド トレーサー RNA (と一緒に目的の genomic 位置に Cas9 をターゲットに隣接しているゲノムのターゲットに特定システムが必要です。一緒に呼ばれる 1 つのガイド RNA または sgRNA)。ここで提案するステップバイ ステップのフィーダーに依存しない、フット プリント無料 iPSC の効率的な生成のためのプロトコルし、iPSC Cas9 リボ核タンパク質 (RNP) 錯体を用いたゲノム編集の方法論を記述します。ゲノムのプロトコルを編集、効果的な Cas9 蛋白質と細胞に同時に提供する 1 つ以上のターゲットの前錯化 sgRNAs で簡単に多重化できます。最後に、必要な編集と Ips の同定と解析のためのシンプルなアプローチについて述べる。一緒に取られて、輪郭を描かれた戦略は、世代とマニホールド用 iPSC の編集を効率化する予定です。
Introduction
初期化因子の過剰発現による多能性の状態に人間の体細胞のリプログラミング病モデル ・再生医療・新薬開発のアプリケーションで幹細胞研究をもたらしました。いくつかの非ウイルス性リプログラミング手法は初期化因子の Ips を生成配信に利用できるが、プロセスは労働集約的な非常に効率的ではありません1。ウイルスの方法が効率的なウイルスの統合および腫瘍2,3,4の問題に関連付けられます。本稿では、初期化因子の彼らのゲノムの5に、ウイルスのベクトル シーケンスの統合が欠如してフット プリント無料 iPSC ラインの確立を提供する細胞質のセンダイ ウイルスの使用を報告します。センダイ ウイルスは RNA ウイルス感染後細胞細胞質 〜 10 通路を希薄化は、迅速かつ効率的な6、7のリプログラミングにつながる豊富に初期化因子を生成です。確立された Ips は、8フィーダー細胞としてマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) の使用を避けるために送り装置自由な媒体に容易に移行することができます。
リプログラミング、センダイ ウイルス媒介のアウトラインだけでなく、文書内 Ips 研究に必要な遺伝的変更と無制限のひと細胞を供給する可能性を秘めているを編集するための改良されたプロトコルについて述べる。Ips は、プールされたライブラリの遺伝子工学、遺伝子発見のスクリーニング、大規模なゲノム削除、ノックアウト ノック アドインを含むアプリケーションの広い範囲が使用されている現在の変更の CRISPR/Cas9 技術を使用しています。多数のモデル生物と遺伝子療法9,10,11。この技法が化膿連鎖球菌の複合体の形成-派生 Cas9 ヌクレアーゼと 20 mer ガイド Rna 3′ 隣接塩基配列 protospacer に隣接するゲノムのターゲット シーケンスと基本ペアリングを介してターゲット認識を達成します。モチーフ (PAM) のシーケンス。Cas9 ヌクレアーゼを二重鎖休憩 〜 3 ヌクレオチド非相同末端結合 (NHEJ) 経路を挿入または開いたリーディング ・ フレームの削除につながるによって主にその後修理されそれにより機能は、PAM のサイトから誘導します。12遺伝子のノックアウト。
私たちの改善されたプロトコルはヒト膵細胞の文化の詳細、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) リプログラミング、フィーダー フリー培養へのそれに続く適応の高効率化を達成するために、有糸分裂でリプログラミング不活化マトリゲル、確立された Ips の特性に CRISPR ガイド RNA の設計、準備、RNP 複合体、編集した Ips のクローンのラインを生成する単一のセルの並べ替え、簡単審査、編集の同定と解析として Ips に配信単一細胞のクローンを作成します。ゲノム削除は Cas9 蛋白質と二重鎖切断 (Dsb) を誘発する 2 つ CRISPR sgRNA RNP 複合体の導入によって、本研究では効率的に生成され、セグメントの介在の削除。このメソッドは開いたリーディング ・ フレームの削除を生成するための 2 つのガイドの使用を活用、高効率の低い数字につながる NHEJ の自動キャピラリーによって特徴付けられる必要、クローンの簡単な事前審査のクローンを作成電気泳動装置、フラグメント アナライザー。これらの効果的なゲノムのひと幹細胞を用いた疾患モデルを生成するメソッドの編集は、幹細胞の研究室で標準的なルーチンのアプローチにすぐになります。最後に、正確なゲノム編集幹細胞病モデルを超えて移動することが可能になるし、潜在的触媒作用で細胞ベースの治療を助けることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Ips にひと体細胞のリプログラミングは基礎生物学研究、個別化医療、疾患モデル作製、医薬品開発、再生医療16の分野に大きな後押しを提供しています。人間 iPSC 世代の多くの現在、広く使用されている方法、ウイルスが宿主ゲノムに統合のリスクを使用するまたは episomal ベクトルの低効率をプログラムし直します。センダイ ウイルス、’無料フット プリント’ や効率的な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ラボで作業員グラント博士アンジャリ Nandal して探索的助成金によって支持されたメリーランド州の幹細胞研究基金に BT (テッドコー) から。
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
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