Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9
Summary
Протокол описывает подробно поколения след бесплатный индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) от человеческих клеток поджелудочной железы в фидер свободных условиях, вслед за этим редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ribonucleoproteins и характеристика изменение клоны одноклеточных.
Abstract
Эмбриональные и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток может самостоятельно обновить и дифференцироваться в несколько типов клеток тела. Плюрипотентных клеток таким образом желанной для исследований в регенеративной медицине и в настоящее время в клинических испытаниях для глазных заболеваний, диабета, заболеваний сердца и других расстройств. Потенциал, чтобы дифференцироваться в типы специализированных клеток в сочетании с последних достижений в геноме, редактирования технологий, включая системы ТРИФОСФАТЫ/Cas предоставили дополнительные возможности для пошива геном iPSC для разнообразных приложений включая моделирование, болезней генотерапии и стабилизатор пути дифференциации, чтобы назвать несколько. Среди доступных технологий редактирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 от Streptococcus pyogenes возникла как инструмент выбора для редактирования участкам генома эукариот. CRISPRs легко доступны, недорогих и высокоэффективных технических целевых изменения. Система требует Cas9 Нуклеаза и руководство последовательности (20-mer), относящиеся к genomic цели примыкающих 3-нуклеотид «НЭС» protospacer рядом мотив (PAM) для ориентации Cas9 желаемого геномной локус, наряду с трассирующими универсальная Cas9 связывания РНК ( Вместе они называются одной руководство РНК или sgRNA). Здесь мы представляем пошаговые протокол для эффективного поколения фидер независимых и свободных след iPSC и описания методологий для изменения генома в iPSC, используя комплексы рибонуклеопротеида (RNP) Cas9. Геном редактирования протокола является эффективным и может быть легко мультиплексируются по pre комплексообразования sgRNAs для более чем одной цели с Cas9 белками и одновременно доставлять в клетки. Наконец мы описываем упрощенный подход для идентификации и определения характеристик iPSCs с желаемых изменений. Взятые вместе, изложил стратегии предполагается упростить создание и редактирование iPSC для многочисленных приложений.
Introduction
Перепрограммирование человека соматические клетки pluripotent государству, гиперэкспрессия перепрограммирования факторов революцию исследования стволовых клеток с приложениями моделирования заболевания, регенеративной медицины и разработки лекарственных средств. Несколько не вирусный перепрограммирования методы доступны для доставки перепрограммирования факторы и генерации iPSCs, но этот процесс является труда интенсивной и не очень эффективно1. Вирусные методы, хотя эффективное, связаны с проблемами вирус интеграции и tumorigenicity2,3,4. В этой рукописи мы сообщают об использовании цитоплазматических Сэндай вируса для доставки перепрограммирования факторы и создания свободных след iPSC линий, которые отсутствие интеграции любой вирусный вектор последовательности в их геном5. РНК вирус, который разводится из клеток цитоплазме ~ 10 ходов после инфекции и производит перепрограммирования факторов в изобилии, приводит к быстрой и эффективной перепрограммирования6,7является Сендай. Установленные iPSCs можно затем легко перешли на фидер свободный средних и избежать использования мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) как фидер клетки8.
В этой публикации, наряду с изложением Сэндай вирус опосредованной перепрограммирования мы также описывают улучшение протокол для редактирования iPSCs, который имеет потенциал, чтобы предоставить неограниченное количество клеток человека с желаемой генетических модификаций для научных исследований. Мы использовали технологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для модификации iPSCs, который в настоящее время используется для широкого спектра приложений, включая стук ins и нокауты, крупномасштабные геномной удаления, Объединенные библиотеки проверки для обнаружения гена, генная инженерия многочисленные модели организмов и генной терапии9,10,11. Этот метод предполагает формирование комплексов Streptococcus pyogenes-производные Cas9 Нуклеаза и 20-mer руководство РНК, обеспечивающие признание целевой через базу сопряжения с геномные последовательности прилегающих к 3′ нуклеотидом protospacer соседними мотив (PAM) последовательности. Cas9 Нуклеаза индуцирует двойной мель перерыв ~ 3 нуклеотидов с PAM сайта, который впоследствии восстановленной преимущественно концу не гомологичных присоединения (NHEJ) путь, ведущий к вставки или удаления в рамках открытой чтении и тем самым функциональным нокаут гены12.
Наша Улучшенная протокол включает в себя сведения о культуре человеческих клеток поджелудочной железы, их перепрограммирования на mitotically инактивированная мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) для достижения более высокой эффективности перепрограммирование, последующей адаптации к культуре фидер бесплатно на Matrigel, характеристика установленных iPSCs, ТРИФОСФАТЫ руководствоваться РНК дизайн и подготовка, Доставка в iPSCs как RNP комплексы, одну ячейку Сортировка для создания клоновых линий редактировать iPSCs, легко отбора и идентификации изменений и характеристика Одноячеистый клонов. Геномной удаления эффективно были созданы в этом исследовании путем введения Cas9 белка и два ТРИФОСФАТЫ sgRNA RNP комплексов побудить двойной мель перерывы (DSBs) и исключить вмешательство сегмента. Этот метод основывается на использовании двух руководств для генерации исключений в рамках открытой чтении, высокая эффективность NHEJ приводит к низкой количество клонов что необходимо охарактеризовать и легко предварительного отбора клонов, автоматизированных капилляров электрофорез блок, фрагмент анализатора. Эти эффективные генома, редактирование методы для создания модели на основе стволовых клеток заболеваний человека вскоре станет стандартной и обычные подход в любой лаборатории стволовых клеток. Наконец точное генома редактирования позволит выйти за рамки моделирования заболевания стволовых клеток и потенциально может помочь стимулировать клетки-терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Перепрограммирование соматических клеток человека к iPSCs предоставила значительный импульс в области фундаментальной биологии исследований, персонализированной медицины, болезни моделирования, разработки лекарственных средств и регенеративной медицины16. Многие текущи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в лаборатории был поддержан докторской стипендии Грант доктор Анджали Nandal и исследовательский грант от Фонда исследований стволовых клеток Мэриленд для BT (ТЕДКО).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
