Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9
Summary
Pronuclear (PN) инъекции кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и ТРИФОСФАТЫ связанные белком-9 нуклеиназы (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) системы является весьма эффективным методом для производства генетически Золотой сирийских хомяков. Здесь мы описываем подробный протокол PN инъекции для производства хомяков Нокаут гена с системой ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Abstract
Pronuclear Техника инъекции (PN) был впервые создан в мышей внести иностранные генетических материалов в pronuclei один клеточной стадии эмбриона. Введено генетический материал может интегрироваться в геноме эмбриональных и создания трансгенных животных с иностранными генетической информации, после передачи вводят эмбрионов для содействия матерям. После успеха в мышей PN инъекции успешно применяется в многих других видов животных. Недавно, PN инъекции успешно проработал представить реагентов с ген изменение видов деятельности, например ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, для достижения конкретных генетических модификаций в нескольких лабораторных и сельскохозяйственных животных. Наряду с овладением Специальный набор навыков микроинъекции производить генетически модифицированных животных путем инъекций PN, исследователи должны понимать воспроизводства физиологии и поведения целевых видов, потому что каждый вид представляет уникальный проблемы. Например, Золотой сирийского хомяка эмбрионы имеют уникальный обработки требований в пробирке , таким образом, что до последних открытий нашей группой PN инъекций методы были невозможны в этот вид. С нашей видов модифицированные PN инъекции протоколом нам удалось в производстве несколько Нокаут гена (KO) и knockin хомяков (KI), которые успешно используются для модели заболеваний человека. Здесь мы описываем процедуры инъекции PN для доставки комплекс Cas9 ТРИФОСФАТЫ зигот хомяка, эмбриона обработки условий, процедур передачи эмбриона, и животноводства, необходимых для производства генетически изменены хомяков.
Introduction
Золотой сирийского хомяка (Mesocricetus auratus) является одним из наиболее широко используемых грызунов для биомедицинских исследований. По данным Департамента сельского хозяйства США около 100,000 хомяков были использованы в Соединенных Штатах в 2015 году, составляет 13% всего лабораторных животных использования среди видов, охватываемых Закон о благосостоянии животных (http://www.aphis.usda.gov; доступ 10 марта 2017).
Хомяк предлагает несколько преимуществ по сравнению с другими грызунами в изучении ряда заболеваний человека. К примеру гистопатология N-nitrosobis(2-oxopropyl) Амин (ПБ) индуцированной поджелудочной железы протоковой аденокарциномы в хомяка похож на человека опухоли поджелудочной железы, в то время как лечение ПБ главным образом вызывает опухоли щитовидной железы у крыс и легких и печени в 1мышей. Потому что хомяков только небольшой грызун, найденных для поддержки репликации аденовирусы, они также являются модель выбора для тестирования на основе аденовирусной онколитического векторов и аденовирус анти наркотики2,3,4. Другой пример, где хомяк модель предлагает преимущество над мышей и крыс находится в исследовании гиперлипидемии. Люди и хомяков выставки большое сходство в липидной метаболических и обоих видов нести ген кодирования передачи белка (ПООППО), Эстер cholesteryl, который играет центральную роль в липидной метаболизмом, а ПООППО отсутствует у мышей и крыс5. Кроме того хомяков развивать геморрагическая болезнь более представительным человеческого проявления после контакта с вирусом Эбола6. Хомяков также являются модели выбора для изучения атеросклероза7, устные карциномы8и9воспалительных миопатий. Недавно также было продемонстрировано что хомяков очень восприимчивы к инфекции вируса Анд и хантавирусный легочный синдром как заболевание, предоставляя только грызунов модель Анд вирусной инфекции10.
Для решения неудовлетворенная потребность Роман генетических животных моделей для изучения заболеваний человека, где нет надежной малых грызунов модель доступна, мы недавно добились успеха в применении системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 хомяк и дали несколько линий генетически инженерии хомяков11. Хомяк зигот очень чувствительны к экологических средах, что протоколы инъекции PN, разработанных в других видов являются неподходящими. Таким образом мы разработали протокол PN инъекции для хомяка, который учитывает особые требования к обработке хомяка эмбрионов в пробирке. Здесь мы описываем подробные процедуры инъекции PN, с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы и сопутствующие шаги, от подготовки единого руководства РНК (sgRNA) для переноса эмбрионы вводят в получателей женщины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы лучше использовать потенциал Золотой сирийских хомячков как модели болезней человека, мы разработали PN инъекции протокол для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 комплекс для хомячка генома. Протокол инъекции PN оптимизирует несколько ключевых переменных, включая эмбриона питательной среды,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в этой публикации было поддержано национальных институтов аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) национальных институтов здоровья под награду номер 1R41OD021979 (для ZW) и исследовательский грант от 21 BioGreen следующего поколения Программа, Республика Корея, Грант нет. PJ01107704 (для ZW) и предоставить нет. PJ01107703 (до IK). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья или BioGreen 21. Мы благодарим д-р Николас Robl для редактирования рукопись.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
