Vivo में मानव वसा की ट्रैकिंग-व्युत्पंन Mesenchymal फ्लोरोसेंट Lipophilic झिल्ली डाई के साथ एक चूहे घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल में स्टेम कोशिकाओं
Summary
इस प्रोटोकॉल एक कुशल तरीका कोशिका हठ और मानव वसा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल द्वारा (haMSCs) की निगरानी के लिए एक चूहा घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (कोाा) मॉडल के माध्यम से इंट्रा-जोड़दार (IA) इंजेक्शन में लाल प्रतिदीप्ति लेबलिंग का वर्णन करता है ।
Abstract
आदेश में मानव वसा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल (haMSC) घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (कोाा) के लिए चिकित्सा के नैदानिक आवेदन का समर्थन करने के लिए, हम सेल हठ और पशु मॉडल में haMSCs के वितरण की प्रभावकारिता की जांच की । हम lipophilic फ्लोरोसेंट डाई के साथ haMSCs के सेल झिल्ली लेबल करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया । बाद में, शल्य चिकित्सा प्रेरित कोाा के साथ चूहों में लेबल कोशिकाओं के इंट्रा जोड़दार इंजेक्शन गतिशील रूप से एक vivo इमेजिंग प्रणाली द्वारा निगरानी की गई । हम lipophilic carbocyanines (DilC18 (5)), एक सुदूर लाल फ्लोरोसेंट दिल (dialkylcarbocyanines) अनुरूप है, जो एक लाल लेजर का उपयोग करने के ऊतकों के आसपास से प्राकृतिक हरी उत्तेजना के autofluorescence से बचने के कार्यरत हैं । इसके अलावा, लाल के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के जीवित पशुओं में डीप ऊतक इमेजिंग की अनुमति दी और लेबलिंग प्रक्रिया कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव या haMSCs को कार्यात्मक क्षति का कारण बना । यह दृष्टिकोण एक चूहे कोाा मॉडल में haMSCs के लिए एक कुशल ट्रैकिंग विधि होना दिखाया गया है । इस विधि के आवेदन भी पूर्व नैदानिक अध्ययन में अन्य स्रोतों से इष्टतम प्रशासन मार्ग और MSCs की खुराक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (कोाा) एक अपक्षयी जोड़दार उपास्थि हानि और प्रगतिशील सूजन है, जो दुनिया भर के बुजुर्गों में एक बड़ी पुरानी बीमारी बन गया है के परिणामस्वरूप विकार है1। हालांकि, वर्तमान चिकित्सा विरोधी भड़काऊ दवाओं का उपयोग, शारीरिक खुराक, और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं केवल रोगसूचक दर्द के लिए अस्थायी राहत प्रदान कर सकते हैं2.
मानव वसा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल (haMSCs) घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के लिए एक होनहार reअपक्षयी उपाय बन गए हैं, उपास्थि पुनर्जनन और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण के लिए उनके multipotent भेदभाव क्षमता के कारण3, 4. vivo मेंकार्रवाई के तंत्र की जांच करने के लिए औषधीय मार्गों के साथ तुलना में, छोटे कोाा पशु मॉडल में लाइव haMSCs ट्रैकिंग वर्तमान में नैदानिक आवेदन करने से पहले haMSC थेरेपी के लिए औचित्य और व्यवहार्यता स्थापित करने के लिए शिक्षाप्रद है । नैदानिक परीक्षण के लिए, औसत दर्जे का meniscectomy (मिमी) संयुक्त के यांत्रिक लोड स्थिर करने के लिए चूहों में कोाा प्रेरित है, जो लगातार reproducibility के साथ एक अपेक्षाकृत व्यवहार्य मॉडल प्रदान करता है5. MM द्वारा प्रेरित कोाा की शुरुआत पूर्वकाल cruciate बंधन अकेले transection या आंशिक औसत दर्जे का meniscectomy6के साथ संयुक्त से पहले है । इसलिए, कोाा के रोग microenvironment के साथ इंजेक्शन haMSCs के बीच दीर्घकालिक बातचीत अक्सर मिमी7,8से प्रेरित चूहों में मूल्यांकन कर रहे हैं.
हालांकि haMSCs की चिकित्सीय प्रभावकारिता बड़े पैमाने पर सूचित किया गया है, इंट्रा जोड़दार (IA) इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यारोपित haMSCs के वीवो में पर प्रासंगिक ज्ञान9,10दुर्लभ है । इसलिए, विभिंन सेलुलर लेबलिंग तरीकों immunohistology11, luciferase12, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन13 अभिकर्मक, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के लिए आयरन ऑक्साइड लेबलिंग (एमआरआई) सहित विकसित किया गया है14 , और कई फ्लोरोसेंट सेल रंजक8,15,16. श्रम के साथ तुलना में गहन प्रोटोकॉल विश्लेषण, vivo में गैर इनवेसिव इमेजिंग वास्तविक समय वितरण और फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ लेबल कोशिकाओं की गतिशीलता का पता लगाने के लिए ऑप्टिकल उपकरणों को रोजगार10,17. कार्यात्मक लाइव सेल इमेजिंग के लिए, cytocompatible फ्लोरोसेंट लेबलिंग एक परिष्कृत रेडियोधर्मी मुक्त ट्रैकिंग तकनीक स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन18के बाद सेलुलर गतिविधियों को प्रकट करने के लिए है । इसके अलावा, बहुरंगा फ्लोरोसेंट lipophilic रंजक अमीनो-प्रतिक्रियाशील हाइड्रोफिलिक रंजक या फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके बेहतर सेल पारगम्यता और बढ़ाया प्रतिदीप्ति क्वांटम पैदावार19सहित, पर लाभ के अधिकारी ।
इस प्रकार, प्रोटोकॉल यहां शामिल एक लाल लेजर का उपयोग करने lipophilic carbocyanines के साथ लेबल कोशिकाओं उत्तेजित (DilC18(5)) है, जो एक दूर लाल फ्लोरोसेंट दिल (dialkylcarbocyanines) एनालॉग20है । लाल उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के परिवर्तन किया है फ्लोरोसेंट हस्तक्षेप से बचा जाता है और जीवित पशुओं में समय की एक लंबी अवधि में गहरी ऊतक इमेजिंग की अनुमति देता है8। किया था के साथ लेबल vivo में कोशिकाओं पर नज़र रखने की यह विधि की निगरानी के लिए मान्य है स्टेम सेल, ऐसे haMSCs के रूप में, पशु मॉडल में, जो समझने के लिए आवश्यक है और वर्तमान स्टेम कोशिका अपक्षयी चिकित्सा में सुधार.
Protocol
पशु विषयों को शामिल करने वाली प्रक्रियाओं को स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया, जिससे पशु दुख को कम करने के प्रयास किए जा रहे हैं । निम्नलिखित प्रोटोकॉल को संस्थागत ?…
Representative Results
Discussion
सुरक्षा मानकों और स्टेम सेल थेरेपी के वितरण के अध्ययन की तत्काल जरूरत है इससे पहले कि हम पीठ से बेडसाइड के लिए कोाा के लिए अपक्षयी स्टेम सेल उपचार ला सकते हैं । हालांकि, रोग पर्यावरण के हठ और प्रत्यारोप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान अध्ययन शंघाई अभिनव वित्त पोषण (1402H294300) शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (CN) डॉ वेन वांग को द्वारा प्रायोजित द्वारा समर्थित किया गया था । हम इस पांडुलिपि के लिए अपनी तकनीकी सहायता और वैज्ञानिक सलाह के लिए डॉ गुआंग्डोंग झोउ (चीन के नेशनल टिशू इंजीनियरिंग सेंटर) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम भी पशु कल्याण में उनकी मदद के लिए श्री Huitang ज़िया (शंघाई नौवें लोगों के अस्पताल) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
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