Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

Summary

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

Abstract

무릎 관절염 (KOA)에 대 한 인간 지방 유래 간 엽 줄기 세포 (haMSC) 치료의 임상 적용을 지원 하기 위해 셀 지의 효능과 동물 모델에서 haMSCs의 biodistribution을 검사 합니다. 우리는 질 성 형광 염료와 haMSCs의 세포 막에 레이블을 하는 방법을 설명 했다. 그 후, 수술로 유도 KOA와 쥐에 있는 레이블된 셀의 내부 관절 주사는 vivo에서 이미징 시스템에서 동적으로 모니터링 했다. 우리는 질 성 고용 carbocyanines 않았다 (DilC₁₈ (5)), 조직 주변에서 자연 녹색 autofluorescence의 자극을 피하기 위해 빨간색 레이저를 활용 하는 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그. 또한, 레드 이동 방출 스펙트럼의 살아있는 동물에서 깊은 조직의 이미징 및 레이블 프로시저 발생 세포 독성 효과 또는 haMSCs 기능 손상을 허용 했다. 이 접근은 쥐 KOA 모델에서 haMSCs에 대 한 효율적인 추적 방법으로 보였다. 이 방법의 응용 프로그램 또한 최적의 관리 경로 및 전 임상 연구에서 다른 소스에서 MSCs의 복용량을 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다.

Introduction

무릎 관절염 (KOA) 관절 연골 손실 및 진보적인 염증, 되 고 있다는 세계¹주위 노인에서 주요 만성 질환 인 퇴행 성 질환 이다. 그러나, 항 염증 제 약물, 물리 보충, 및 수술 절차를 사용 하 여 현재 치료만 증상 통증²에 대 한 임시 구호를 제공할 수 있습니다.

무릎 관절염, 연골 재생, immunomodulatory 속성^{3, 잠재적인 multipotent 그들의 차별화 때문에 유망한 재생 치료 되 고 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs) 4}. 약리학 노선 vivo에서행동의 메커니즘을 조사와 비교 하면, 현재 유익에 대 한 근거 및 임상 응용 프로그램 이전 haMSC 치료의 타당성을 확립 하는 작은 KOA 동물 모델에서 라이브 haMSCs를 추적. 전 임상 시험에 대 한 중간 meniscectomy (MM) destabilizes 일관 재현성⁵상대적으로 가능한 모델을 제공 합니다 쥐, KOA를 유도 하 관절의 기계적 부하. KOA m M에 의해 유도 된의 발병은 전방 십자 인 대 transection 혼자 또는 결합 부분 중간 meniscectomy⁶보다 이전. 따라서, KOA의 병 적인 microenvironment로 주입 된 haMSCs 간의 장기 상호 작용 종종 m M^7,8에 의해 유도 된 쥐에 평가 됩니다.

비록 haMSCs의 치료 효능에 광범위 하 게 보고, 관련 지식이 하고있다 내 관절 (IA) 주입을 통해 이식된 haMSCs의 비보에 지 속성 부족^9,10입니다. 따라서, 다양 한 세포 표시 방법은 개발 되었다, immunohistology¹¹, luciferase¹², 녹색 형광 단백질¹³ transfection, 자기 공명 영상 (MRI)^{14에 대 한 라벨 산화 철을 포함 하 여} , 그리고 수많은 형광 셀 염료^8,,1516. 노동 집약적인 조직학 분석 비교, vivo에서 비 침략 적 영상 실시간 유통 및 형광 신호^10,17으로 표시 하는 셀의 역학을 감지 하는 광학 장치를 사용 합니다. 기능 라이브 셀 이미징에 대 한 cytocompatible 형광 라벨 줄기 세포 이식¹⁸후 세포 활동을 공개 하는 정교한 무료 방사성 추적 기술입니다. 또한, 다 색 형광 닥터지 염료 친수성 아미노산 반응성 염료 나 형광 단백질, 그들의 향상 된 세포 침투성 등 향상 된 형광 양자 수율¹⁹이점을 있습니다.

따라서, 여기에 포함 된 프로토콜 활용 빨간색 레이저 질 성 carbocyanines로 표시 하는 세포를 자극 했다 (DilC₁₈(5)), 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그²⁰입니다. 빨간색 이동 여기 및 방출 스펙트럼 autofluorescent 간섭 방지 않았다 하 고 깊은 조직 동물⁸시간의 긴 기간 동안 이미징 있습니다. 추적의이 방법은 세포 vivo에서 표시 한은 이해 하 고 현재 줄기 세포 재생 치료 개선에 필수적인 동물 모델에서 haMSCs 같은 이식된 줄기 세포 모니터링에 적합.

Protocol

동물 주제와 관련 된 절차 동물 고통 최소화 하는 노력으로 현지 기관 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 했다. 다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 상해 9 사람들에 의해 승인 되었다 ’ 병원 프로토콜 상하이 교통 대학의과 대학에 가입 하는 s 번호 [2017] 063. 1. Surgically-Induced 쥐 무릎 관절염 모델의 설립 이 수술, 250, 300 g. 사이 몸 무게와 함께 사용…

Representative Results

KOA 모델을 유도 하기 위하여 m M SD 쥐 (그림 3)의 오른쪽 무릎 관절에 수행 되었다. 수술 후 8 주 쥐 희생 했다 고 무릎 관절의 직렬 섹션 두 H로 평가 했다 &와 Safranin O/빠른 그린 얼룩 (그림 4). H에 대 한 & 전자 얼룩, 관절 연골의 표면 전시 보다 수술을 하지 않고 정상적인 관절 수술 무릎에 거칠어 테두리. Safranin O/빠른 그린 …

Discussion

우리는 머리 맡에 벤치에서 코 아에 대 한 재생 줄기 세포 치료를 가져올 수 있는 전에 안전 표준 및 줄기 세포 치료의 biodistribution 연구 절실히 필요는 합니다. 그러나, 질병의 병 적인 환경 지 속성에 biodistribution 이식된 haMSCs¹⁰의 중요 한 역할을 재생합니다. 최근, 우리의 그룹 보다 정상적인 조건을⁸에서 주사 병 적인 KOA 환경 haMSCs의 내부 관절 주사 이상 유지는…

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None