En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

Summary

Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).

Abstract

Para apoyar la aplicación clínica de humano adiposo derivado mesenquimal (haMSC) terapia de células madre para la artrosis de rodilla (KOA), examinamos la eficacia de la persistencia de la célula y la biodistribución de haMSCs en modelos animales. Hemos demostrado un método para etiquetar la membrana de la célula de haMSCs con colorante fluorescente lipofílico. Posteriormente, la inyección intraarticular de las células etiquetadas en ratas con KOA quirúrgico inducido fue monitoreada dinámicamente por un en vivo sistema de imagen. Se empleó el lipofílico carbocyanines hizo (DilC₁₈ (5)), un far-red análogo fluorescente de Dil (dialkylcarbocyanines), que utiliza un láser rojo para evitar la excitación de la autofluorescencia verde natural de los tejidos circundantes. Además, los espectros de emisión rojo-cambiado de puesto de permitir la proyección de imagen de tejidos profundos en animales vivos y el procedimiento de etiquetado no causaron efectos citotóxicos o daño funcional de haMSCs. Este enfoque ha demostrado ser un método de seguimiento eficiente para haMSCs en un modelo de ratas KOA. La aplicación de este método podría utilizarse también para determinar la vía de administración óptima y la dosis de MSCs de otras fuentes en los estudios preclínicos.

Introduction

Osteoartritis de rodilla (KOA) es un desorden degenerativo, resultantes de la pérdida de cartílago articular y la inflamación progresiva, que se ha convertido en una enfermedad crónica importante en los ancianos en el mundo¹. Sin embargo, los tratamientos actuales con fármacos antiinflamatorios, suplementos físicos y procedimientos quirúrgicos sólo pueden proporcionar alivio temporal de dolor sintomático².

Humanas derivado de adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) se han convertido en un prometedor remedio regenerativo para la osteoartritis de la rodilla, debido a su diferenciación multipotent potencial para regeneración de cartílago e inmunomoduladores propiedades^{3, 4}. En comparación con vías farmacológicas para investigar mecanismos de acción en vivo, seguimiento de haMSCs vivo en modelos animales de pequeño KOA es actualmente instructivo para establecer la razón de ser de y la factibilidad de la terapia de haMSC antes de la aplicación clínica. Para las pruebas preclínicas, meniscectomy medial (MM) desestabiliza la carga mecánica de la articulación para inducir KOA en ratas, que ofrece un modelo relativamente factible con reproducibilidad constante⁵. La aparición de KOA inducida por MM es anterior a la transección del ligamento cruzado anterior sola o combinada con parcial meniscectomy intermedio⁶. Por lo tanto, las interacciones a largo plazo entre haMSCs inyectado con el microambiente patológico de KOA son a menudo evaluadas en ratas inducidas por MM^7,8.

Aunque la eficacia terapéutica de haMSCs ha sido ampliamente divulgado conocimiento relevante sobre la persistencia en vivo de haMSCs implantado mediante inyección intra-articular (IA) es escaso^9,10. Por lo tanto, distintos métodos de etiquetado celulares han sido desarrollados, incluyendo el immunohistology¹¹, luciferasa¹², transfección de¹³ proteína fluorescente verde, óxido de hierro de etiquetado para la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)¹⁴ y numerosas células fluorescentes tintes^8,15,16. Comparado con el análisis de la histología de la mano de obra intensiva, en vivo no invasivo la proyección de imagen emplea dispositivos ópticos para detectar la distribución en tiempo real y dinámica de las células etiquetadas con señales fluorescentes^10,17. Para la proyección de imagen funcional de células vivas, etiquetado fluorescente de cytocompatible es una técnica de sofisticado rastreo radioactivo libre para revelar actividades celulares después de trasplante de células madre¹⁸. Por otra parte, tintes lipofílicos fluorescentes multicoloras poseen ventajas sobre tintes hidrófilos amino reactivos o proteínas fluorescentes, incluyendo la permeabilidad de la célula mejorada y mayor fluorescencia cuántica rendimientos¹⁹.

Por lo tanto, los protocolos aquí utilizan un rojo láser para excitar las células etiquetadas con carbocyanines lipofílico hizo (DilC₁₈(5)), que es un far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico²⁰. Los espectros de excitación y emisión rojo-cambiado de puesto de evita autofluorescent interferencia y permite la proyección de imagen durante un largo período de tiempo en animales vivos⁸de tejidos profundos. Este método de seguimiento de células en vivo con que es válido para el monitoreo de células madre trasplantadas, tales como haMSCs, en modelos animales, que es esencial para entender y mejorar la actual terapia regenerativa con células madre.

Protocol

procedimientos con sujetos animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional local y Comité de ética, con un esfuerzo para minimizar el sufrimiento de los animales. El siguiente protocolo fue aprobado por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) en Shanghai novena personas ’ s Hospital afiliado a Shanghai JiaoTong University School of Medicine con el protocolo número [2017] 063. 1. establecimiento de un modelo de artrosis de rodilla de ratas de Surgically-I…

Representative Results

Para inducir el modelo KOA, MM fue realizado en la articulación de la rodilla derecha de ratas SD (figura 3). Ocho semanas después de la cirugía, las ratas fueron sacrificadas y las secciones seriadas de empalmes de la rodilla se evaluaron con dos H & E y Safranina O/Fast Green tinción (figura 4). H & E la coloración, la superficie del cartílago articular exhibió las fronteras más ásperas en las rodillas de cirug…

Discussion

Normas de seguridad y estudios de biodistribución de terapia de células madre están urgente antes de que podemos llevar tratamiento regenerador de células madre para el KOA del Banco a la cabecera. Sin embargo, el medio ambiente patológico de la enfermedad desempeña un papel importante en la persistencia y la biodistribución de trasplantados haMSCs¹⁰. Recientemente, nuestro grupo demostró que la inyección intraarticular de haMSCs persistió ya en un ambiente patológico de KOA de las inye…

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None