בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי
Summary
כתב יד זה מתאר מודל מאתר osteolysis calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo, המהווה מודל חיה אידיאלית להערכת הגומלין שבין חלקיקי ללבישה, תאים שונים התרופפות אספטי.
Abstract
ללבוש חלקיקים-induced osteolysis הוא הגורם העיקרי התרופפות aseptic בכישלון שכיחיםהחלפת, אבל המנגנון הבסיסי נותר לא ברור. בשל זמן מעקב לצורך זיהוי, מופע ספורדי, זה מאתגר כדי להעריך את osteolysis של ofparticle-induced פתוגנזה במקרים קליניים. ומכאן, מודלים בעלי חיים אופטימלי יש צורך בלימודים. המודל מאתר של osteolysis calvarial נוסדה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי יעיל וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo קודם מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח-ריכוז של 50 מ”ג/מ”ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. אחרי שבועיים, העכברים הוקרבו, דגימות calvaria נבצרו; הערכות כמותיים בוצעו על ידי hematoxylin אאוזין מכתים ו טומוגרפיה מיקרו. נקודות החוזק של מודל זה כוללים פשטות ההליך, הערכה כמותית של איבוד מסת העצם, רגע, osteolysis, להשתמש הפוטנציאל הטרנסגניים או נוקאאוט מודלים ופיתוח בעלות נמוכה יחסית. עם זאת, מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את כוח מכני ואת ההשפעות כרונית של חלקיקי התרופפות אספטי. המודל מאתר osteolysis calvarial שנוצר על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין ללבוש חלקיקים שונים תאים, למשל, מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם ובין osteoclasts, ב התרופפות אספטי.
Introduction
התרופפות aseptic הוא הגורם הנפוץ ביותר של שכיחיםהחלפת היפ הכולל (THA) וכישלון שכיחיםהחלפת (TKA) ברך הכולל, אשר דורש ניתוח תיקון1. עם זאת, המנגנון הבסיסי נותר לא ברור2. מעקב ארוך נדרש לזהות חלקיקים-induced osteolysis, אשר מופע נדיר; לכן, זה מאתגר לחקור שלה פתוגנזה במקרים קליניים. לפיכך, מחקרים נוספים התמקדות מנגנונים מורכבים הסלולר ורקמות דורשים שני ניסויים ויוו ב ללבוש מודלים של חלקיקים-induced osteolysis, מבחני במבחנה בתאים הקשורים עצם הומאוסטזיס3. מודל בעלי חיים חוקי חשוב לחשוף את ההשפעות של חלקיקים ללבוש על איבוד העצם, מתן הוכחות נוספות הסלולר מבחני.
מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא שיטה יעילה וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo לגרום calvarial osteolysis על ידי גרימת ציטוקינים דלקתיים ב מקרופאגים, הפעלת osteoclasts, מעכבות התפשטות אוסטאובלסט קידום אוסטאובלסט אפופטוזיס.
זה לוקח רק שבועיים להקים מודל זה. Osteolysis יכול להיות דמיינו לכמת על ידי hematoxylin אאוזין (H & E) מכתים, מיקרו שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT)2. בנוסף, מודל זה יש עכבר יחסית בעלות נמוכה, הטרנסגניים ואת נוקאאוט מודלים יכול לשמש למסך מספר רב של תרכובות מינונים שונים3.
הנוהל כדי לבסס והערכה של מודל זה הוא פשוט. ראשית, חלקיקי CoCrMo מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ”ג/מ”ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. העכברים הוקרבו אחרי שבועיים ולאחר calvaria דגימות נבצרו; ניתוחים כמותיים בוצעו על ידי H & E מכתים andmicro-טי
מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין חלקיקים CoCrMo תאים שונים, כגון מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם osteoclasts, ב התרופפות אספטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן שתי שיטות עיקריות עבור ללבוש חלקיקים-induced osteolysis בעכברים: המודל אוויר-נרתיק ודגם calvarial osteolysis. במודל כיס אוויר, אוויר-נרתיק subcutaneously שנוצר קודם נוסדה, ואחריו ללבוש חלקיקים מבוא השרשה לתוך רקמת העצם8. הקיר נרתיק מחקה קרום העצם, התרופפות אספטי. עם זאת, עצם ההשתלה הוא nonvascular עם אי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81572111), קליניים מדע טכנולוגיה פרויקט קרן של מחוז ג’יאנגסו (BL2012002), מדעי למחקר פרוייקט של נאנג’ינג (201402007), מדעי הטבע קרן של מחוז ג’יאנגסו (BK20161385), קרן מיוחדת התאגדות רופא סיני (2015COS0810).
Materials
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
