Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

Summary

L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato – encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Abstract

Le but du présent protocole présente une procédure optimisée pour la purification et la culture du pBECs et à établir des modèles in vitro barrière hémato – encéphalique (BHE) basés sur pBECs en mono-culture (MC), MC avec milieu conditionné par l’astrocyte (ACM), et co-culture (NCC) avec les astrocytes de porc sans contact ou des rat origine. pBECs ont été isolées et cultivées à partir de fragments des capillaires du cortex du cerveau des porcs domestiques âgés de 5 à 6 mois. Ces fragments ont été purifiées par extraction soigneuse des méninges, l’isolement et l’homogénéisation de la matière grise, filtration, digestion enzymatique et centrifugation. Pour éliminer les autres cellules contaminantes, les fragments capillaires ont été cultivées avec contenant la puromycine moyen. Lorsque confluente de 60 à 95 %, pBECs de plus en plus des fragments capillaires ont été repiquées à filtre à membrane perméable insère et mis en place dans les modèles. Pour augmenter l’étanchéité de la barrière et le BBB phénotype caractéristique de pBECs, les cellules ont été traitées avec les facteurs de différenciation suivant : membrane perméable 8-CPT-cAMP (cAMP abrégé ici), hydrocortisone et un inhibiteur de la phosphodiestérase, RO-20-1724 (RO). La procédure a été réalisée sur une période de 9 à 11 jours, et en établissant le modèle du NCC, les astrocytes ont été cultivés 2 à 8 semaines à l’avance. Respect des procédures décrites dans le protocole a permis la mise en place de couches endothéliales avec perméabilité paracellulaire très restreint, avec la CCN modèle montrant une résistance électrique moyenne transendothéliale (TEER) de 1249 ± 80 cm Ω ²et la perméabilité paracellulaire (P_app) pour le jaune Lucifer de 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm s^-1 (moyenne ± SEM, n = 55). Une évaluation plus poussée de ce phénotype pBEC a montré la bonne expression de la protéines jonctionnelles serré claudin 5, ZO-1, occludin et adherens jonction protéine p120 caténine. Le modèle présenté peut être utilisé pour une série d’études de la BHE dans la santé et la maladie et la perméabilité paracellulaire très restrictives, ce modèle convient aux études de transport et trafic intracellulaire.

Introduction

Structure cellulaire et le fonctionnement de la barrière hémato – encéphalique

À l’interface de l’appareil circulatoire et système nerveux central (SNC), la BHE agit comme un site réglementaire clé pour contrôle homéostatique du microenvironnement CNS, qui est indispensable à leur fonctionnement et de la protection du système nerveux. Le site de la BHE est les cellules endothéliales tapissant la lumière du vaisseau sanguin. Dans les capillaires du cerveau, les cellules endothéliales forment complexes jonctions intercellulaires et profils d’expression fortement polarisée de particuliers transporteurs influx et l’efflux de veiller très spécifique transport moléculaire entre le sang et le cerveau ¹. Les composants structurels des complexes de jonction serrée incluent des protéines de la famille occludin et claudin, les protéines zonula occludens (ZO), les cingulin et associés des molécules d’adhésion jonctionnelles (confitures). Claudin 5 est particulièrement important dans la limitation jonctionnelle paracellulaire. L’induction et l’entretien de ce phénotype caractéristique d’endothéliales BBB impliquent des interactions dynamiques avec les cellules environnantes, y compris les péricytes et astrocytes, neurones, les membranes basales, qui, avec le cerveau endothéliale, forme des cellules le neurovasculaire unité (NVU)^2,3. Les mécanismes impliqués dans ces interactions ne sont pas encore entièrement compris, mais incluent l’échange de signaux chimiques entre les cellules, ce qui permet la modulation de la perméabilité BBB à court terme et induit à long terme BBB fonctions⁴. Astrocytes en particulier sont connus pour contribuer au phénotype de cellules endothéliales du cerveau et sont une source de facteurs de régulation tels que gliales neurotrophiques facteur (affectant l’AMPc intracellulaire)⁵, facteur de croissance de fibroblaste base⁶, hydrocortisone,⁷et transformant le facteur de croissance β (TGF-β)⁸. L’effet du TGF-β, cependant, a été débattue⁹.

In Vivo pour In Vitro BBB

Des études in vivo continuent à fournir des informations précieuses sur la biologie BBB. Cependant, les modèles de culture de cellules peuvent apporter un éclairage supplémentaire et constituent des outils utiles à la compréhension détaillée des aspects moléculaires et fonctionnelles de la BHE dans santé et maladie. Bien que les interactions complexes entre les types de cellules et les constituants de la BHE sont difficiles à atteindre dans des modèles in vitro , il y a eu, depuis la première purification de cellules endothéliales du cerveau et l’application de celles-ci dans les mono-cultures ^{10 , 11 , 12}, développé des procédures de purification et des conditions de croissance de la BHE cell cultures modèles, ce qui entraîne une plus grande ressemblance avec la barrière en vivo . Les modèles BBB couramment utilisés in vitro sont basés sur les cellules primaires d’origine bovine, porcine et rongeur ainsi que sur les lignées cellulaires immortalisées. Chaque modèle a des inconvénients et des avantages différents. Pour le choix de modèle et de la comparaison, marqueurs de validation comme l’expression des enzymes, transporteurs, récepteurs et protéines structurales BBB sont utilisés pour donner un aperçu de l’actuelle de modèles établis¹.

Objectif du protocole

Une caractéristique importante de la BHE est étanchéité barrière et haute TEER, pourtant un grand nombre de modèles disponibles ne reflète pas bien les niveaux en vivo . Intégrant le développement et l’optimisation des contributions de plusieurs laboratoires, le but du présent protocole est de présenter une méthode pour établir un haut TEER in vitro BBB modèle basé sur pBECs primaire en MC avec ou sans l’ACM, ou dans le NCC avec primaire astrocytes de rat ou d’origine porcine. L’appliqué les procédures et la mise en place du modèle comprennent les efforts pour éliminer les cellules contaminantes et améliorer la différenciation des pBECs en un phénotype BBB. Ce travail a abouti à la création de modèles TEER fiables et de haute perméabilité paracellulaire faible et bonne expression fonctionnelle de récepteurs, transporteurs et principales protéines jonctionnelles serrés. Cependant, comme les astrocytes sont un facteur qui contribue au phénotype de cellules endothéliales du cerveau, les trois différentes conditions de culture représentent trois différents phénotypes de cellules endothéliales du cerveau. Le modèle de la NCC est particulièrement utile pour l’étude de certains mécanismes spécialisés participent à la découverte de médicaments, des études de transport et trafic intracellulaire, ainsi que pour l’étude des interactions cellule-cellule où est l’expression maximale des caractéristiques BBB avantageuse.

Origine et histoire du protocole

Le modèle pBEC décrit ici est largement basé sur le modèle porcin développé dans les laboratoires Eisai (Londres) par Dr Louise Morgan et collègues, whichis basée sur un succès antérieure du cerveau de boeuf cellules endothéliales modèle¹³. La méthode originale de préparation de cellules a été une filtration de deux étages à l’aide de nylon des maillages pour intercepter les microvaisseaux, suivis d’une subculture afin d’améliorer la pureté. Dans l’élaboration antérieure de la méthode, étanchéité optimale de BBB phénotype et barrière ont été atteints par la croissance dans un milieu supplémenté, y compris les ACM. Autres modifications à la méthode ont été faites par R. Skinner dans laboratoire du Prof N. Rothwell de Manchester UK^14,15. La méthode a été adoptée par le laboratoire Abbott, KCL London, où Patabendige rend considérablement plus simple à préparer en évitant l’utilisation des astrocytes ou ACM et en éliminant les cellules contaminantes telles que les péricytes avec puromycine. Les premiers documents ont confirmé que le modèle MC conservé plusieurs caractéristiques importantes du in vivo BBB, y compris des jonctions serrées efficaces, les systèmes de transport membranaire et transcytose médiée par les récepteurs^{16,17 , 18 , 19 , 20}. plus tard S. Yusof encore testé culture mixte d’astrocytes et trouvé il a nettement amélioré TEER, donc il s’agit de la variante préférée actuellement utilisée dans le laboratoire de Abbott²¹. Le modèle a été correctement transféré à la M. Nielsen lab à Aarhus, où des modifications ont été introduites (ce protocole), y compris les gris simplificatrice d’importance extraction, à l’aide de maillage qu’une étape de filtration et une étape de revêtement de filtre unique combinaison de collagène et la fibronectine. La procédure appliquée pour l’isolement des astrocytes porcins (ce protocole) reposait sur des protocoles mis au point par le laboratoire de T. Moos à Aalborg, décrite par Thomsen et al.²². La TEER et autres propriétés du modèle généré à Londres et Aarhus sont semblables, ce qui donne confiance à l’idée que le modèle est facilement transféré entre les laboratoires et réagit bien à une observation attentive et de la rationalisation des étapes de la méthode. En effet, S. Yusof a maintenant établi le modèle de MC dans un pays tropical (Malaisie)²³, qui impliquait un ajustement supplémentaire pour des conditions locales et les sources de tissus.

Avantages par rapport aux méthodes alternatives et actuellement mis en place des modèles

Par rapport aux cellules endothéliales du cerveau d’origine bovine et rongeur, pBECs offrent l’avantage d’avoir un taux plus faible de la perte de la phénotype BBB in vivo après isolement²⁴. En outre, les pBECs sont capables de former des barrières endothéliales relativement serrés, même lorsque cultivées en MC (Ω 800 cm²)¹⁶ par rapport aux niveaux communément déclarés pour les monocouches de lignées cellulaires tels que bEND.5 et bEND.3 (Ω 50 cm²) ^{25 , 26 , 27}, cEND (300-800 Ω cm²)^28,29,30et cerebEND (Ω 500 cm²)^29,31,32et cerveau primitif cellules endothéliales de souris (100-300 Ω cm²)SS = « xref » > 33^,34,35,36 et rat (100-300 Ω cm²)^37,38. Cependant, la TEER a montré dépendance sur les procédures de purification et de la culture. Dans la plupart des cas, l’ajout de ACM ou de co-culture avec des astrocytes montre des effets divergents sur les cellules endothéliales et une augmentation dans l’étanchéité des couches endothéliales¹. Néanmoins, avec les efforts visant à optimiser les conditions de culture, seulement les modèles axés sur les bovins ont montré des valeurs TEER comparables aux modèles axés sur les porcins (moyennes de 800 Ω cm² dans MC, jusqu’à 2500 Ω cm² en culture mixte d’astrocytes)^{13 ,39,40,41,42,43,44,45}. Comme les modèles basés sur le cerveau de boeuf primaire les cellules endothéliales ont montré des variations importantes, entre et au sein de laboratoires^{14,45,46,47,48}, reproductibilité pourrait être un problème. Dans le modèle pBEC rapporté ici, les laboratoires qui contribuent ont atteint TEER très similaire et les valeurs de perméabilité paracellulaire avec une faible variabilité, dans et entre les laboratoires. Par conséquent, il devrait être possible pour les autres laboratoires d’établir un modèle robuste avec une faible variabilité à l’aide de la méthode présentée ici. En formant des couches endothéliales serrés, plus de modèles avec pBECs ont déjà été validés par l’expression des protéines des jonctions serrées, fonctionnelle BBB transporteurs, récepteurs et enzymes et les qualités démontrées pour une série d’études de^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. par ailleurs, transcriptome inédit des données sur les cultures co de pBECs montrent un profil attendu des transporteurs BBB et récepteurs (résultats non publiés, Nielsen et al.).

Le modèle porcin de BBB a un autre avantage que le génome, l’anatomie, la physiologie, et la progression de la maladie du porc reflètent la biologie humaine à un degré plus élevé que les autres modèles établis dispose de⁶⁰, qui sont favorables pour le industrie pharmaceutique. Cervelle de porc est un sous-produit courant de la filière viande, elles constituent une source facilement accessible du cerveau des cellules endothéliales, réduisant au minimum le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences et offrant un rendement élevé de purification d’un cerveau de porc. Bien que la purification et la culture de cellules primaires est un peu fastidieux et nécessite l’expertise de normalisation dans la mise en place du modèle, les cellules primaires génèrent les modèles plus fiables de la BBB. Lignées cellulaires immortalisées ne peuvent se substituer, en tant que propriétés importantes telles que l’étanchéité de la barrière, des profils d’expression transporteur et microenvironnement ne reflètent pas les résultats expérimentaux obtenus in vivo^{61, 62}. in vitro modèles offrent l’avantage de vivre-cellule d’imagerie avec une résolution supérieure, permettant la visualisation de processus intracellulaires en permettant une approche de proximité aux cellules prélevés ou observées, à l’aide d’objectifs avec un grossissement supérieur et de la meilleure qualité optique⁶³. Ce n’est pas le cas pour l’utilisation de la microscopie biphotonique chez les individus vivants. En outre, les modèles in vitro permettent de transfecter cellules, permettant la visualisation de protéines étiquetées et enquête de leur trafic.

Applications du modèle

La fonction de cette barrière n’est pas fixe et peut être modulée dynamiquement en physiologie et en pathologie. Dans de nombreuses maladies neurologiques, y compris neurodégénératives, maladies inflammatoires et infectieuses, perturbation et augmentation de la perméabilité de la BHE est observé^64,65,66,67 . Afin de réduire et de prévenir la progression de la maladie et les dommages ultérieurs, identification et caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la modulation de la BHE sont d’une importance majeure. Dans ce contexte, fiable in vitro modèles sont très demandés par l’industrie pharmaceutique et en outre un rôle important dans la prédiction de perméabilité BBB de médicaments pour le système nerveux central. N’importe quel modèle in vitro agissant comme un écran de perméabilité doit afficher une voie paracellulaire restrictive, une architecture cellulaire physiologiquement réaliste et une expression fonctionnelle de transporteur mécanismes⁶⁸. Démontré dans les précédentes études^16,17,57et par la perméabilité paracellulaire et expression de protéines TJ et AJ ici, le modèle présenté répond à tous ces critères et convient à une gamme de BBB études dans les deux physiologie normale et en pathologie. Les points forts de la méthode de purification et de culture présentée comprennent une combinaison de simplicité et de la reproductibilité et la possibilité d’inclure astrocytaires influencent avec un robuste et fiable haute TEER in vitro BBB modèle résultant. Pour ce but, les astrocytes de porc et rat origine auraient dû être divulgués pour augmenter le phénotype BBB de pBECs dans une semblable manière²².

Protocol

cervelle de porc ont été obtenues comme sous-produits de l’industrie des produits alimentaires danois. Les abattoirs danois sont sous stricte surveillance et d’observation par le Ministère danois de l’environnement et de la nourriture. rats utilisés pour l’isolement des astrocytes ont été élevés et logés en groupe dans l’animalerie locale à une température ambiante de 22 ° C à 23 ° C et sur un cycle de clair/sombre du 12/12 h sous contrôle du vétérinaire et selon d…

Representative Results

Mise en place des modèles In Vitro BBB Dans la méthode présentée, optimisée, culture de pBECs et l’établissement du système insert membrane perméable avec MC ou sans ACM ou NCC avec les astrocytes (Figure 1) a été réalisées pour une période de 9 à 11 jours (Figure 2). Pour la sélection des cellules endothéliales, une culture initiale des fragment…

Discussion

Purification et prolifération des pBEC

Au cours de la procédure de purification, étapes critiques incluent une élimination rapide et efficace des méninges et la séparation de la matière blanche et grise, ce qui est important pour le rendement de la purification et la pureté et la mise en place correcte du modèle. Pour le BBB présenté en vitro modèle d’à l’aide de pBECs, nous avons amélioré et simplifié d’une procédure de purification basée sur l’homogénéisatio…

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc