G2-seq: जीनोम के देर से नकल क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक उच्च प्रवाह अनुक्रमण आधारित तकनीक
Summary
हम जीनोम के देर से नकल क्षेत्रों की पहचान करने के लिए प्रवाह cytometry और उच्च प्रवाह अनुक्रमण संयोजन के लिए एक तकनीक का वर्णन ।
Abstract
कई तकनीकों सेल चक्र के एस चरण के माध्यम से डीएनए प्रतिकृति की प्रगति का पालन करने के लिए विकसित किया गया है । इन तकनीकों के अधिकांश स्थान और इसके पूरा होने के बजाय जीनोम दोहराव की दीक्षा के समय के elucidation की ओर निर्देशित किया गया है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि हम जीनोम के क्षेत्रों को समझने की है कि पूरा करने के लिए पिछले कर रहे है प्रतिकृति, क्योंकि इन क्षेत्रों गुणसूत्र टूटना और उत्परिवर्तन का स्तर ऊंचा उठाया, और वे दोनों रोग और उंर बढ़ने के साथ जुड़े किया गया है । यहां हम वर्णन कैसे हम एक तकनीक है कि प्रतिकृति दीक्षा की निगरानी करने के बजाय पिछले जीनोम के उन क्षेत्रों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया गया है विस्तारित है पूरा प्रतिकृति । इस दृष्टिकोण प्रवाह cytometry और उच्च प्रवाह अनुक्रमण का एक संयोजन पर आधारित है । हालांकि इस रिपोर्ट खमीर करने के लिए इस तकनीक के आवेदन पर केंद्रित है, दृष्टिकोण किसी भी कोशिकाओं है कि एक प्रवाह cytometer में डीएनए सामग्री के अनुसार हल किया जा सकता है के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
Eukaryotic जीनोम प्रतिकृति एकाधिक असतत साइटों पर शुरू की है, प्रतिकृति के मूल कहा जाता है, जिसमें से प्रतिकृति कांटे दोनों दिशाओं में आगे बढ़ना (Fragkos एट अल., 20151में समीक्षित) । मूल दोनों अपने समय और गोलीबारी की क्षमता में भिंनता है, और कई तकनीकों को प्रतिकृति मूल गतिविधि की निगरानी और इस भिंनता के कारणों स्पष्ट विकसित किया गया है । व्यक्तिगत मूल की गतिविधि एकल-असहाय डीएनए के स्तर से आस्थगित किया जा सकता है2, जो सक्रिय मूल के आसपास रूपों, या 2d जेल ट्रो का उपयोग करने के लिए विशिष्ट प्रतिकृति मध्यस्थों की निगरानी के लिए3, जिनमें से दोनों के साथ पता लगाया जा सकता है रेडियोधर्मी जांच । इन तकनीकों के दोनों अधिक आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में एस cerevisiae में लागू कर रहे हैं, क्योंकि मूल पूर्व में विशिष्ट ज्ञात दृश्यों तक ही सीमित हैं । microarrays के आगमन के साथ, यह विश्व स्तर पर गोलीबारी मूल का आकलन करने के लिए संभव हो गया । यह सबसे पहले भारी आइसोटोप के साथ डीएनए लेबल द्वारा किया गया था, एक G1 ब्लॉक से प्रकाश आइसोटोप युक्त में कोशिकाओं को रिहा, और फिर4जीनोम के पार भारी प्रकाश संकर डीएनए के गठन की निगरानी. उच्च प्रवाह अनुक्रमण की शुरूआत महंगी isotopic लेबलिंग की आवश्यकता के बिना मूल गतिविधि के समान जीनोम की व्यापक निगरानी की अनुमति दी । कोशिकाओं को एक प्रवाह cytometer में डीएनए सामग्री और उनके डीएनए गहरी अनुक्रमण के अधीन के अनुसार हल किया गया । क्योंकि अनुक्रम कवरेज एस चरण के पाठ्यक्रम पर 1x से 2x के लिए आय, सापेक्ष प्रतिकृति समय एस चरण में कोशिकाओं के G1 या G25,6में पढ़ने की गहराई की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । इन तकनीकों, विशेष रूप से खमीर के लिए लागू किया, कैसे डीएनए अनुक्रम, क्रोमेटिन संरचना, और डीएनए प्रतिकृति प्रोटीन के एक गहरी समझ के लिए नेतृत्व की उत्पत्ति समय और दक्षता को विनियमित ।
के दौरान आनुवंशिक जानकारी के वफादार संचरण सेलुलर प्रसार के सफल दीक्षा की आवश्यकता नहीं है डीएनए प्रतिकृति, जो मूल पर जगह लेता है, लेकिन यह भी पुनरावृत्ति के सफल समापन, जो होता है जहां प्रतिकृति कांटे मिलते हैं । प्रतिकृति की दीक्षा की तरह, प्रतिकृति के पूरा होने के समय भी सेल चक्र में देर से प्रतिकृति शेष कुछ क्षेत्रों के साथ जीनोम भर में बदलता है । ऐसे क्षेत्रों सक्रिय प्रतिकृति मूल से विशेष रूप से दूर हो सकता है या अनुक्रम या क्रोमेटिन संरचनाओं कि डीएनए polymerases बाधा हो सकती है । देर से नकल क्षेत्रों खुद नाजुक साइटों के रूप में प्रकट कर सकते हैं, जो गुणसूत्र टूटना और उच्च उत्परिवर्तन दरों के साथ जुड़े रहे हैं, और कैंसर में फंसा दिया गया है और7एजिंग,8,9। हालांकि, जीनोम स्थिरता के रखरखाव में डीएनए प्रतिकृति के उचित पूरा होने के महत्व के बावजूद, जहां और कैसे इस जगह लेता है की हमारी समझ अभी तक प्रतिकृति दीक्षा के पीछे है । और जब व्यक्तिगत जीन जिनकी देर प्रतिकृति रोग के साथ संबद्ध किया गया है के साथ अध्ययन किया गया है, उदाहरण के लिए, qPCR10, वैश्विक elucidating में निर्देशित अध्ययन स्थानों और देर से पुनरावृत्ति के अंतर्निहित कारणों का अभाव हो गया है । यहाँ हम एक तकनीक का वर्णन हम के रूप में “G2 seq” जिसमें हम उच्च प्रवाह sequencing के साथ फ्लो cytometry गठबंधन करने के लिए खमीर में जीनोम प्रतिकृति के पूरा होने पर प्रकाश डालता है11। छोटे परिवर्तन के साथ, इस प्रोटोकॉल किसी भी कोशिकाओं है कि प्रवाह के लिए डीएनए सामग्री के अनुसार हल किया जा सकता है अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि इस तकनीक मजबूत और अपेक्षाकृत सीधे आगे है, विशेष रूप से ध्यान निंनलिखित के लिए समर्पित किया जाना चाहिए:
(1) हम अनुशंसा करते है कि संस्कृतियों से कम 12 घंटे के लिए बढ़ने से पहले वे लॉग चरण त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अटल बिहारी को ग्रांट NIH GM117446 ने समर्थन दिया था
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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