Summary

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Published: March 22, 2018
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Summary

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット シーケンスを結合する手法について述べる。

Abstract

多数の技術は、細胞周期の S 期で DNA 複製の進行状況を追跡する開発されています。これらの技術のほとんどは、場所の解明とゲノム重複ではなく、その完了の開始時期に向かって指示されています。しかし、我々 はこれらの地域の染色体の破損や、突然変異レベルが上昇に苦しむので、レプリケーションを完了する最後はゲノムの領域を理解し、彼らは病気と高齢化に関連付けられていることが重要です。ここで我々 は我々 が代わりにレプリケーションを完了する最後のゲノムのこれらの領域を識別するために複製開始反応を監視するために使用されている技術を拡張する方法について説明します。このアプローチは、フローサイトメトリーと高スループット シーケンスの組み合わせに基づいています。このレポートは、この手法の酵母への応用に焦点を当て、アプローチは DNA の内容によると流れの cytometer で並べ替えることができます任意のセルで使用できます。

Introduction

真核生物ゲノムのレプリケーションは、レプリケーションでは、レプリケーションからフォーク (Fragkos2015年1文献) 両方の方向で進むの起源と呼ばれる複数の個別サイトで開始されます。起源が異なるタイミングと、焼成の効率とレプリケーション元のアクティビティを監視し、この変化の原因を解明するいくつかの手法が開発されました。個々 の原点の活動は、単一座礁させた DNA2、アクティブな起源の周りのフォームのレベルから推論できるまたは特定の複製中間体3を監視する第 2 ゲルの電気泳動を使用して、どちらで検出できます。放射性プローブ。起源は、前者の特定の知られていたシーケンスに制限され、これらの手法の両方はより簡単に出芽酵母よりも哺乳類セルので適用されます。マイクロ アレイの出現により、世界的に焼成の起源を評価することが可能になりました。これは最初重い同位体と DNA の分類、中含まれている軽い同位体に G1 ブロックから細胞を放出、重・軽ハイブリッド DNA ゲノム4の形成を監視によって行われました。高スループット シーケンスの導入許可同様ゲノムは、高価な同位体ラベリングの要件なしで活動を起源の監視します。細胞は、DNA の内容によると流れの cytometer のディープ シーケンスを受ける DNA ソートされます。シーケンスのカバレッジが S 期にわたって 2 倍に 1 x から進むにつれて、ので相対的なレプリケーションのタイミングは G1 あるいは G25,6S 期細胞の読み取りの深さを比較することによって評価できます。特に酵母に適用これらのテクニックは、dna 塩基配列、クロマチン構造と DNA 複製タンパク質起源タイミングと効率の規制方法のより深い理解につながった。

細胞増殖の中に遺伝情報の忠実な伝達には、DNA の複製の起源で行われるの唯一の成功の開始だけでなく、複製フォークが満たすために発生するレプリケーションが正常に完了が必要です。レプリケーションの開始のようなレプリケーションの完了のタイミングは、残りの細胞周期の後半でもレプリケートされていない特定の領域にゲノム間で異なります。このような領域は特にアクティブな複製の起源から遠いかシーケンスやクロマチン構造の DNA ポリメラーゼを阻害する場合があります。後期地域をレプリケートする染色体の破損および高い突然変異率と関連付けられ、がんと老化7,8,9に関与している壊れやすいサイトとして自分自身のマニフェストことができます。しかし、ゲノムの安定性の維持に DNA の複製が正しく完了の重要性にもかかわらずこれが起こる場所と方法の理解が遅れてレプリケーション開始。後半レプリケーションは病気に関連付けられている個々 の遺伝子の中で、たとえば、qPCR10場所の解明と後半のレプリケーションを欠けている原因の基礎となるグローバル研究検討されています。ここで我々 は”G2 seq”高スループット シーケンスのゲノム複製の完了に光を当てるとフローサイトメトリーを組み合わせる我々 として酵母の11を参照手法について述べる。軽微な変更は、このプロトコルは DNA 量順の流れをすることができます任意のセルに合わせることができます。

Protocol

1 のセルの準備の流れ Cytometry の並べ替え 文化一晩成長後 5 x 106 1.5 mL あたり7セルを 10 倍の密度に達するような YEPD 液 8 mL を含む 15 mL の試験管を接種する (注 1 の議論」を参照)。 酵母 (1,400 × g、室温、4 ° C で) 5 分 15 mL スクリュー キャップ遠心管でスピンダウン、1.5 mL 70% エタノールで 1.6 の mL および microfuge の管に転送この座っている部屋の温度で 1 時間ま?…

Representative Results

我々 は出芽酵母における後半の複製サイトを識別するために上記の手順を使用しています。人工染色体の知られている遅い複製領域を使用してこの方法をテストを正確かつ信頼性の高い技術を証明しました。我々 の結果も示しているレプリケーションのタイムリーな完了の生物学的重要性染色体 7、我々 は G2 seq 結果に基づいて後期複製として識別、後期複製領域が…

Discussion

一方、この手法は堅牢で、比較的まっすぐな前方、特に注意は次に捧げられるべき。

(1) 以来、文化は接種後必要な密度だけ 4 h に到達した後収穫される場合細胞周期の分布に相違が顕在ログ段階に達する前に少なくとも 12 時間の文化が成長するを推奨します。我々 の仮定では比較的安定した平衡に達した細胞周期の分布はより飽和させた文化は、最近では新鮮な媒体に…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事は a. b. に NIH GM117446 助成金によって支えられました。

Materials

YeaStar Genomic DNA kit Genesee Scientific 11-323
1 µM SYTOX Green ThermoFisher 57020 resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL) Sigma R6513 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL) ThermoFisher / Invitrogen 25530-015 resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB50A220
BD Biosciences FACSAria II BD Biosciences 644832
Zymo-spin III columns Zymo Research C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator Covaris 500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Illumina 15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument Illumina SY–401–2501 
gsnap alignment software open source software / Genentech http://research-pub.gene.com/gmap

References

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Cite This Article
Foss, E. J., Lao, U., Bedalov, A. G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome. J. Vis. Exp. (133), e56286, doi:10.3791/56286 (2018).

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