التحديد الكمي للتهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من الأفراد ذوي الأمراض المزمنة التحريضية

Summary

يصف لنا وضع بروتوكول لقياس الهجرة الداخلية وحيدات عبر مونولاييرس بطانية البشرية وعلى نضج اللاحقة إلى خلايا الرغاوي. وهذا يوفر طريقة مرنة لتقييم خصائص atherogenic وحيدات معزولة عن الناس مع ظروف المرض المختلفة وتقييم العوامل في الدم التي قد تعزز هذا الميل.

Abstract

مرض الشريان التاجي (CAD) سبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. تصلب الشرايين، رائدة يسبب كندي، تبدأ بالتهجير وحيدات المناعة الفطرية لمواقع تحريضية المودعة دهن يسمى الشرائط الدهنية، التي موجودة في جدران الشرايين المتوسطة للشرايين الكبيرة. الميزة الرئيسية المسببة للأمراض للآفات في هذه المرحلة المبكرة من تصلب الشرايين هو نضوج وحيدات التي تهاجر إلى الشرايين لتشكيل خلايا الرغاوي أو الضامة محملة بالدهن. أدلة كثيرة تدعم الفرضية القائلة بأن يزداد خطر تصلب الشرايين بالظروف الملتهبة المزمنة المصاحبة لأمراض مثل التهاب المفاصل، وفيروس نقص المناعة البشرية، فضلا عن الشيخوخة عامة، وأن هذا الخطر المتوقع الوحيدات التنشيط. بينما نماذج الماوس يوفر منبرا جيدا التحقيق في دور وحيدات في أثيروجينيسيس في فيفو، أنها تتطلب التعديلات الوراثية استقلاب الكولسترول الطبيعية وتغيير جذري من الماوس العادي الوجبات الغذائية، وحدت من صلاحية دراسة التأثيرات atherogenic الأمراض البشرية المرضية. وهذا دفعتنا إلى وضع نموذج بشرية في المختبر لقياس إمكانات atherogenic وحيدات المعزولة من الأفراد المصابين بمرض محدد الدول. حاليا، تعمل على الحد من النماذج البشرية في المختبر في ذلك أنهم تقييم تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات في عزلة. هنا يمكننا وصف بروتوكول الذي ترانسميجراتي وحيدات معزولة من دم المريض عبر الخلايا البطانية البشرية في مصفوفة الكولاجين من نوع 1، وميلها إلى أن تنضج إلى خلايا الرغاوي في وجود أو عدم وجود الدهن الخارجية يقاس. تم التحقق من البروتوكول لاستخدام الإنسان وحيدات تنقيته من الأفراد المصابين بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والمسنين فيروس نقص المناعة البشرية وقاية الأفراد. هذا النموذج هو تنوعاً ويسمح الوحيدات التهجير والرغوة تشكيل خلية تقييم استخدام أما مجهرية أو التدفق الخلوي، فضلا عن السماح لتقييم العوامل atherogenic الموجودة في المصل أو البلازما.

Introduction

التهجير الوحيدات هو خطوة حاسمة في تطوير لوحة تصلب الشرايين قد تؤدي إلى تجلط الدم والسكتة الدماغية واحتشاء عضلة القلب. تطوير لويحات تصلب الشرايين من الشرائط الدهنية، عموما موجودة في مواقع تدفق الدم المنخفض متذبذبة في المتوسطة للشرايين الكبيرة، حيث يساهم في تفعيل غشائي الدهن المودعة والمترجمة التهاب¹. وحيدات ويجند إلى خلايا بطانية في الشرائط الدهنية عن طريق البروتينات chemotactic الوحيدات (مثل CCL2)، وترانسميجراتي في البطانية². وبعد التهجير، قد تشكل وحيدات الضامة atherogenic، محملة بالدهن تسمى خلايا الرغاوي نتيجة لامتصاص الدهون، والدهون التوليف، أسفل-تنظيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم أو مزيج من العوامل المذكورة أعلاه. أيضا قد وحيدات تتراكم الدهون في الدورة الدموية وقد ‘مزبد’ النمط الظاهري، ربما مؤهبة الخلايا للرغوة خلية تشكيل^3،4. خلايا الرغاوي هي السمة المميزة للشرائط الدهنية ولويحات تصلب الشرايين في مرحلة مبكرة وتشكيلاتها ويتأثر بالدهن ووسطاء التهابات⁵. وبدلاً من ذلك، وحيدات لديها القدرة على عكس ترانسميجراتي من الشريان في مجرى الدم⁶، وبالتالي إزالة الدهن من البطانية والنيابة للحفاظ على صحة الشريان.

تحديد ميل وحيدات إلى ترانسميجراتي عبر البطانة الشريانية وشكل رغوة الخلايا البطانية، أو لعكس ترانسميجراتي وتحمل الدهون خارج اللوحة، وهو مطلب أساسي لفهم دور التنشيط الوحيدات في زيادة خطر تصلب الشرايين. نماذج الماوس من الأوغاد مثل تصلب الشرايين هامة في توضيح المعلومات في الوقت الحقيقي في فيفو الانتصارات الدهنية/تصلب الشرايين البلاك التنمية. ومع ذلك، تتطلب هذه النماذج من تعديلات وراثية الكولسترول الطبيعية تجهيز قدرات هذه الحيوانات عادة ما تكون مقترنة بتغييرات جذرية في النظام الغذائي (مثل نموذج النظام الغذائي نوع الذين/الغربية)^7،8، وبالتالي، حمل تراكم غير الفسيولوجية لتعميم المادة الدهنية المستويات الذي وضع اللوحة محرك الأقراص. قد تكون هذه النماذج محدودة تتصل بالظروف البشرية الالتهابات المزمنة مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، التي لا ترتبط بزيادة تعميم مستويات low-density lipoprotein (LDL) أو الكوليسترول. وعلاوة على ذلك، جعل الاختلافات بين البشر والفئران في البيولوجيا الوحيدات اختبار المناعية أسئلة فيما يتعلق بمدى ملاءمة للفئات السكانية الفرعية وحيدات (مثل وحيدات الوسيطة (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ صعبة. هذا مهم عند دراسة آليات القيادة الأمراض القلبية الوعائية كما التهم الوحيدات الوسيطة بشكل مستقل التنبؤ بأحداث القلب والأوعية الدموية^10،11. على الرغم من وجود فحوصات لقياس التتابع أما الوحيدات التهجير أو الرغوة تشكيل الخلية في عزلة، تم التحقق من لا تحليل في المختبر للتحديد الكمي لكل جوانب atherogenesis المبكر باستخدام نفس الخلايا من الأفواج السريرية. نماذج ترانسويل الاستفادة من نظام مجلسين Boyden معدلة حيث يتم تحميلها إلى قاعة كبار الخلايا وترانسميجراتي عبر الحاجز البلاستيكية المسامية أو أحادي الطبقة خلية في مجلس النواب الذي عادة ما يحتوي على وسائط الإعلام مع تشيمواتراكتانت^{12 , 13}-حين تستخدم على نطاق واسع لتحليل الكريات البيض التهجير، هذه النماذج لا تتضمن عموما طبقة تمثل البطانية، أسفر عن الخلايا ترانسميجراتيد هاجروا إلى الحل، ولا تسمح بقياس الخلية الرغوة تشكيل أو الهجرة العكسية من نفس الخلايا. على العكس من ذلك، نماذج لتشكيل خلية الرغاوي لا تراعي أي تغييرات ترانسميجراتوري الناجمة عن وحيدات أو آثار غشائي التنشيط التي من المعروف أن تسهم رغوة الخلية تشكيل¹⁴. وعلاوة على ذلك، حمل هذه النظم رغوة تشكيل خلية من الضامة التقيد بلوحات ثقافة الخلية بإضافة تشبع تركيزات خارجية المؤكسد low-density lipoprotein (أوكسلدل)^15،16، ومحفِّز رئيسي تشكيل خلية الرغاوي. LDL المستخدمة في هذه النماذج هي غالباً ما تتأكسد بغير-فيزيولوجيا-العمليات ذات الصلة مثل CuSO₄ العلاج¹⁷، ولذلك التشكيك في أهمية الفسيولوجية للدراسات باستخدام هذه النماذج.

هنا يصف لنا مقايسة التي يوضحها التهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من نفس الخلايا التي لا تتطلب إضافة أوكسلدل الخارجية، وبالتالي تحسين نمذجة دور وحيدات في تشكيل خلية الرغاوي. هذا النموذج قد وضعت أصلاً من قبل البروفيسور ويليام مولر (جامعة نورث وسترن، شيكاغو)¹⁸، وقد تم صقل في المختبر لتقييم السابقين فيفو أثيروجينيسيتي وحيدات معزولة تحت عدم تفعيل شروط من الأفراد مع الظروف الكامنة وراء الالتهابات المصاحبة للأمراض مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية¹⁹ ، فضلا عن الشيخوخة²⁰، التي ترتبط بزيادة خطر الإصابة بتصلب الشرايين. هذا النموذج أيضا منبرا للرد على الأسئلة البيولوجية الأساسية فيما يتعلق بالميل لمجموعات فرعية مختلفة الوحيدات إلى شكل رغوة خلايا²⁰، تأثير غشائي التنشيط بواسطة السيتوكينات مثل تنف في تشكيل خلية الرغوة¹⁴ ، وخصائص الهجرة وحيدات مثل عمق وسرعة من التهجير في الهلام¹⁹. وعلاوة على ذلك، تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات يمكن قياسها كمياً باستخدام الفحص المجهري القياسية، يعيش تصوير الخلية، التدفق الخلوي وتصوير التدفق الخلوي، وبالتالي، توفر طريقة مرنة لتقييم دور وحيدات في أثيروجينيسيس.

Protocol

ملاحظة: أجريت جميع التجارب باستخدام العينات البيولوجية البشرية بموافقة الأخلاق من “الفريد مستشفى أخلاقيات اللجنة الإنسان”، ملبورن. أجريت جميع التجارب في خزانات “السلامة الثاني فئة” ما لم يتم تحديد. " بريوارميد " يشير إلى كواشف حرارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. 1. الجل ا?…

Representative Results

التحديد الكمي للتهجير الوحيدات وحيدات يتم إضافتها إلى النموذج كما هو موضح في الشكل 1، والمواد الهلامية ستة مستعدون لكل شرط. وحيدات للهلام 6 كل الجهات المانحة (أي5.0 × 104 وحيدات كل المواد الهلامية هلام 6 = 3….

Discussion

ويتيح البروتوكول الموصوفة هنا طريقة تنوعاً وفسيولوجيا ذات الصلة لتقييم أثيروجينيسيتي وحيدات من الأفواج السريرية البشرية، عن طريق الجمع بين التهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي. هذا الطراز يوفر مزايا أكثر من الأساليب البديلة لتشكيل خلية رغوة كما أنه يأخذ في الاعتبار أثر التهجير الوحيدا…

Materials

Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10X M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1X)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)