Vi beskriver en protokol for at måle transmigration af monocytter på tværs af menneskelige endotel monolag og deres efterfølgende modning i skum celler. Dette giver en alsidig metode at vurdere egenskaberne atherogene af monocytter isoleret fra folk med forskellige sygdomstilstande og evaluere faktorer i blodet, som kan forbedre denne tilbøjelighed.
Koronararteriesygdom (CAD) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Åreforkalkning, en førende årsag til CAD, er initieret af transmigration af medfødte immun monocytter til inflammatoriske websteder af deponerede lipid kaldet fede striber, som er til stede i arteriel vægge af medium til store arterier. Patogene hovedaksen i læsioner på dette tidlige stadium af åreforkalkning er en modning af monocytter, som vandrer ind i arterierne til at danne skum celler eller lipid-laden makrofager. Betydelige beviser støtter den hypotese, at risikoen for åreforkalkning er steget med kroniske betændelsestilstande ledsagende sygdomme som leddegigt og HIV, samt generel aldring, og at denne risiko er forudsagt af monocyt aktivering. Mens musen modeller giver en god platform for at undersøge rollen af monocytter i atherogenesis i vivo, de kræver genetisk ændring af naturlige kolesterol metabolisme og drastiske ændring af normal mus kost, og har begrænset anvendelsesegnethed undersøgelse af atherogene påvirkninger af menneskers komorbide sygdomme. Dette motiverede os til at udvikle en menneskelig in vitro- model for at måle den atherogene potentiale af monocytter isoleret fra personer med definerede sygdomstilstande. I øjeblikket begrænser menneskelige in vitro- modeller i at de vurdere monocyt transmigration og skum celle dannelse i isolation. Her beskriver vi en protokol som monocytter isoleret fra patientens blod transmigrate i endothelial celler ind i en type 1 kollagen matrix, og deres tilbøjelighed til at modnes i skum celler i tilstedeværelse eller fravær af eksogene lipid måles. Protokollen er blevet valideret for brugen af humane monocytter renset fra personer med HIV-infektion og ældre HIV inficerede individer. Denne model er alsidig og giver mulighed for monocyt transmigration og skum celle dannelse skal vurderes ved hjælp af enten mikroskopi eller flowcytometri samt giver mulighed for vurdering af atherogene faktorer til stede i serum eller plasma.
Monocyt transmigration er et afgørende skridt i udviklingen af aterosklerotiske plak, der kan føre til blodpropper, slagtilfælde og myokardieinfarkt. Aterosklerotiske plaques udvikle fra fede striber, generelt findes på lokaliteter af lav oscillerende blodgennemstrømningen i medium til store arterier, hvor deponerede lipid bidrager til endotel aktivering og lokaliseret betændelse1. Monocytter rekrutteres i endothelial celler i fede striber via monocyt kemotaktisk proteiner (f.eks CCL2) og transmigrate i intima2. Efter transmigration, kan monocytter danne atherogene, lipid-laden makrofager kaldet skum celler som følge af lipid optagelse, lipid syntese, ned-regulering af cholesterol efflux eller en kombination af de ovennævnte faktorer. Monocytter kan også ophobes lipider i omløb og har en ‘skummende’ fænotype, eventuelt disponerende celler for skum celle dannelse3,4. Skum celler er den definerende funktion af fede striber og tidlige aterosklerotiske plaques og deres dannelse er påvirket af både lipid og inflammatoriske mediatorer5. Alternativt, monocytter har evnen til at vende transmigrate fra arterie i blodbanen6, derved fjerne lipid fra intima og handler for at bevare sundheden af arterie.
Bestemmelse af tilbøjelighed af monocytter til transmigrate på tværs af arteriel endothelium og danne skum celler i intima, eller at vende transmigrate og bære lipid ud af plak, er en afgørende forudsætning for forståelse af monocyt aktivering i stigende rolle aterosklerotisk risiko. Musemodeller af CADs som åreforkalkning er vigtige i belyse real-time i vivo oplysninger på fede streak/aterosklerotisk plaque udvikling. Disse modeller kræver imidlertid en genetisk ændring af naturlige kolesterol forarbejdning evner af disse dyr, som regel kombineret med drastiske ændringer i kost (såsom ApoE-/-Western-type diæt model)7,8, dermed, inducerende ikke-fysiologisk ophobning af cirkulerende lipid niveauer som drev plaque udvikling. Disse modeller kan have begrænset relevans for kroniske inflammatoriske menneskelige lidelser såsom HIV-infektion som ikke er forbundet med øget cirkulerer kolesterol eller low-density lipoprotein (LDL) niveauer. Desuden forskelle i monocyt biologi mellem mennesker og mus gør testning af immunologiske spørgsmål om relevansen af delpopulationer af monocytter (såsom mellemliggende monocytter (CD14++CD16+))9 vanskeligt. Dette er vigtigt, når man studerer de mekanismer, der er drivkraften bag hjerte-kar-sygdom som mellemliggende monocyt tæller forudsige uafhængigt kardiovaskulære hændelser10,11. Mens assays eksisterer for at sekventielt måle enten monocyt transmigration eller skum celle dannelse i isolation, er ingen i vitro assay blevet valideret for kvantificering af begge aspekter af tidlig atherogenesis ved hjælp af de samme celler fra kliniske kohorter. Transwell modeller udnytte en modificeret Boyden to-kammer system, hvorved cellerne er indlæst i det øverste kammer og transmigrate på tværs af en porøs plastbarriere eller celle éncellelag til et andetkammer, der typisk indeholder medier med chemoattractant12 , 13. mens almindeligt anvendt til at analysere leukocyt transmigration, disse modeller ikke generelt optage et lag, der repræsenterer intima, hvilket resulterer i transmigrated celler migrerer til løsning, og tillader ikke for måling af skum celle dannelse eller omvendt transmigration af de samme celler. Omvendt, modeller af skum celle dannelse ikke højde for eventuelle transmigratory-induceret ændringer monocytter eller effekter i endothelial aktivering, som er kendt for at bidrage til at skum celle dannelse14. Desuden, disse systemer fremkalde skum celle dannelse af makrofager levet op til celle kultur plader ved tilsætning af mætte koncentrationer af eksogene oxideret low-density lipoprotein (oxLDL)15,16, en nøgle inducer af skum celle dannelse. LDL anvendes i disse modeller er ofte oxideres af ikke-fysiologisk-relevante processer såsom CuSO4 behandling17, derfor sætter spørgsmålstegn ved den fysiologiske betydning af studier ved hjælp af disse modeller.
Her beskriver vi en analyse, der kvantificerer monocyt transmigration og skum celle dannelse af de samme celler som ingen kræver tilføjelsen af eksogene oxLDL, dermed bedre modellering af monocytter i skum celle formation rolle. Denne model blev oprindeligt udviklet af Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, og har været yderligere raffineres i vores laboratorium for at vurdere ex vivo atherogenicity af monocytter isoleret under ikke-aktivering forhold fra enkeltpersoner med underliggende betændelsestilstande ledsagende sygdomme såsom HIV infektion19 samt aldring20, der er forbundet med en øget risiko for åreforkalkning. Denne model giver også en platform for at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål vedrørende tilbøjelighed af forskellige monocyt delmængder form skum celler20, indflydelse i endothelial aktivering af cytokiner såsom TNF på skum celle dannelse14 , og de vandrende egenskaber af monocytter som dybden og hastighed af transmigration i geler19. Derudover monocyt transmigration og skum celle dannelse kan kvantificeres ved hjælp af standard mikroskopi, live celle imaging, flow flowcytometri og imaging flowcytometri, derfor giver en alsidig metode til at vurdere rollen af monocytter i atherogenesis.
Protokollen beskrevet her tilbyder en alsidig og fysiologisk relevante metode for vurdering af atherogenicity af monocytter fra humane kliniske kohorter, ved at kombinere både monocyt transmigration og skum celle dannelse. Denne model tilbyder fordele i forhold til alternative metoder til skum celle dannelse som det tager højde for effekten af monocyt transmigration på skum celle dannelse og giver mulighed for måling af reverse transmigration6 ud over de iboende monocytter tilbøjelighed til a…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne parlamentsarbejdet Prof. William Muller og Dr. Clare Westhorpe arbejde for deres centrale rolle i udviklingen af tidligere gentagelser af denne model. Forfatterne vil også gerne takke AMREP Flow flowcytometri kerne for sortering af monocyt delmængder og Alfred Hospital smitsomme sygdom enhed klinisk forskning sygeplejersker til ansættelse af HIV + personer for nogle undersøgelser. Forfatterne parlamentsarbejdet bidrag til dette arbejde i den Victoria operationelle infrastruktur Support Program modtaget af Burnet Institute. TAA er understøttet af en RMIT University Vice-kansler postdoc stipendium. Dette arbejde blev støttet af NHMRC project grant 1108792 tildeles AJ og AH. TK er støttet af NIH tilskud NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Gel preparation reagents | |||
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopy | |||
1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry | |||
Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasticware | |||
96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |