जीर्ण भड़काऊ शर्तों के साथ व्यक्तियों से Monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के ठहराव
Summary
हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए मानव endothelial monolayers और उनके फोम कोशिकाओं में बाद में परिपक्वता के पार monocytes द्वारा स्थानांतरगमन उपाय । यह विभिंन रोग की स्थिति के साथ लोगों से अलग monocytes के atherogenic गुणों का आकलन करने के लिए और रक्त में कारकों का मूल्यांकन जो इस प्रवृत्ति को बढ़ा सकते है एक बहुमुखी विधि प्रदान करता है ।
Abstract
कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । Atherosclerosis, सीएडी का एक प्रमुख कारण, monocytes जमा लिपिड के भड़काऊ साइटों के लिए जंमजात प्रतिरक्षा के स्थानांतरगमन द्वारा शुरू की है फैटी धारियां बुलाया, जो मध्यम की धमनी की दीवारों में बड़ी धमनियों के लिए मौजूद हैं । atherosclerosis के इस प्रारंभिक चरण में घावों की प्रमुख रोगजनक सुविधा monocytes की परिपक्वता जो फोम कोशिकाओं या लिपिड लादेन मैक्रोफेज फार्म के लिए धमनियों में विस्थापित है । काफी सबूत परिकल्पना का समर्थन करता है कि atherosclerosis के जोखिम क्रोनिक भड़काऊ रोगों जैसे रुमेटी गठिया और एचआईवी के साथ साथ, साथ ही सामांय उंर बढ़ने के साथ वृद्धि हुई है, और है कि इस जोखिम monocyte द्वारा की भविष्यवाणी की है सक्रियण. जबकि माउस मॉडल एक अच्छा मंच के लिए vivo मेंatherogenesis में monocytes की भूमिका की जांच प्रदान करते हैं, वे प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल चयापचय और सामांय माउस आहार के कठोर परिवर्तन के आनुवंशिक परिवर्तन की आवश्यकता है, और के लिए सीमित उपयुक्तता है मानव comorbid रोगों के atherogenic प्रभावों का अध्ययन । यह हमें प्रेरित इन विट्रो मॉडल में एक मानव विकसित करने के लिए monocytes की atherogenic क्षमता को मापने के लिए परिभाषित रोग राज्यों के साथ व्यक्तियों से अलग । वर्तमान में, मानव इन विट्रो मॉडल में सीमित है कि वे अलगाव में monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन का मूल्यांकन कर रहे हैं । यहां हम एक प्रोटोकॉल में जो monocytes मानव endothelial कोशिकाओं में रोगी रक्त transmigrate से अलग एक प्रकार में 1 कोलेजन मैट्रिक्स, और उनके प्रवृत्ति उपस्थिति या exogenous लिपिड की अनुपस्थिति में फोम कोशिकाओं में परिपक्व करने के लिए मापा जाता है का वर्णन । प्रोटोकॉल मानव एचआईवी संक्रमण और बुजुर्ग एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के साथ व्यक्तियों से शुद्ध monocytes के उपयोग के लिए मांय किया गया है । इस मॉडल बहुमुखी है और monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन या तो माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से atherogenic सीरम या प्लाज्मा में मौजूद कारकों के आकलन की अनुमति का मूल्यांकन किया जा अनुमति देता है ।
Introduction
Monocyte स्थानांतरगमन atherosclerotic पट्टिका के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है कि घनास्त्रता, स्ट्रोक और रोधगलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । Atherosclerotic सजीले टुकड़े फैटी धारियां से विकसित, आम तौर पर बड़ी धमनियों के लिए मध्यम में कम थरथरानवाला रक्त प्रवाह की साइटों पर मौजूद है, जहां जमा लिपिड endothelial सक्रियण और स्थानीयकृत सूजन के लिए योगदान देता है1. Monocytes monocyte chemotactic प्रोटीन के माध्यम से फैटी धारियां में endothelial कोशिकाओं को भर्ती कर रहे है (जैसे CCL2 के रूप में) और transmigrate में intima2। स्थानांतरगमन के बाद, monocytes atherogenic, लिपिड लादेन मैक्रोफेज लिपिड के साथ एक परिणाम के रूप में फोम कोशिकाओं कहा जाता है, लिपिड संश्लेषण, नीचे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति के विनियमन या उपरोक्त कारकों का एक संयोजन के रूप में हो सकता है । Monocytes भी संचलन में लिपिड जमा कर सकते हैं और एक ‘ फोम ‘ phenotype है, संभवतः फोम सेल गठन के लिए3,4के लिए संवेदनशील कोशिकाओं । फोम कोशिकाओं फैटी धारियाँ और प्रारंभिक चरण atherosclerotic सजीले टुकड़े की परिभाषित करने की सुविधा है और उनके गठन दोनों लिपिड और भड़काऊ मध्यस्थों से प्रभावित है5. वैकल्पिक रूप से, monocytes खून में धमनी से transmigrate रिवर्स करने की क्षमता है6, जिससे intima से लिपिड को हटाने और धमनी के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए अभिनय.
monocytes की प्रवृत्ति का निर्धारण करने के लिए transmigrate में धमनी endothelium और फार्म फोम कोशिकाओं में intima, या रिवर्स transmigrate और ले लिपिड पट्टिका से बाहर, बढ़ाने में monocyte सक्रियण की भूमिका को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है atherosclerotic जोखिम । काडों जैसे atherosclerosis के माउस मॉडल्स में elucidating रीयल-टाइम में महत्वपूर्ण है vivo जानकारी में फैटी लकीर/atherosclerotic पट्टिका विकास । हालांकि, इन मॉडलों आमतौर पर आहार में कठोर परिवर्तन (जैसे ApoE-/पश्चिमी प्रकार के आहार मॉडल के रूप में) के साथ युग्मित इन जानवरों के प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल प्रसंस्करण क्षमताओं का एक आनुवंशिक परिवर्तन की आवश्यकता7,8, जिससे, उत्प्रेरण गैर-शारीरिक परिसंचारी लिपिड स्तर जो पट्टिका विकास ड्राइव का संचय । इन मॉडलों को एचआईवी संक्रमण जो वृद्धि परिसंचारी कोलेस्ट्रॉल या कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) के स्तर के साथ जुड़े नहीं है के रूप में पुरानी भड़काऊ मानव स्थितियों के लिए सीमित प्रासंगिकता हो सकता है । इसके अलावा, मनुष्यों और चूहों के बीच monocyte जीव विज्ञान में अंतर monocytes (जैसे मध्यवर्ती monocytes (CD14+ +CD16+))9 की उपजनसंख्या की प्रासंगिकता के बारे में प्रतिरक्षा प्रश्नों के परीक्षण करना मुश्किल. यह महत्वपूर्ण है जब मध्यवर्ती monocyte गिनती के रूप में हृदय रोग ड्राइविंग तंत्र का अध्ययन स्वतंत्र रूप से हृदय की घटनाओं10,11की भविष्यवाणी । जबकि परख के लिए क्रमिक रूप से मापने के लिए या तो monocyte स्थानांतरगमन या अलगाव में फोम सेल गठन, कोई इन विट्रो परख है नैदानिक साथियों से एक ही कोशिकाओं का उपयोग जल्दी atherogenesis के दोनों पहलुओं को बढ़ाता है के लिए मांय किया गया है । Transwell मॉडल एक संशोधित Boyden दो चैंबर प्रणाली जिससे कोशिकाओं शीर्ष चैंबर में भरी हुई है और एक छिद्रित प्लास्टिक बाधा या सेल monolayer भर में एक निचले कक्ष है कि आम तौर पर chemoattractant12 के साथ मीडिया में शामिल है का उपयोग , 13. Whilst व्यापक रूप से ल्युकोसैट स्थानांतरगमन का विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, इन मॉडलों को आम तौर पर एक intima का प्रतिनिधित्व परत, जन्मांतर समाधान में पलायन कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप शामिल नहीं है, और फोम सेल के माप के लिए अनुमति नहीं है एक ही कोशिकाओं के गठन या रिवर्स स्थानांतरगमन । इसके विपरीत, फोम सेल गठन के मॉडल किसी भी transmigratory प्रेरित परिवर्तन monocytes या endothelial सक्रियण जो फोम सेल गठन14में योगदान करने के लिए जाना जाता है के प्रभाव के लिए नहीं खाते । इसके अलावा, इन प्रणालियों exogenous ऑक्सीकरण कम घनत्व लिपोप्रोटीन (oxLDL)15,16, एक प्रमुख उत्प्रेरण के संतृप्त सांद्रता के अतिरिक्त द्वारा सेल संस्कृति प्लेट का पालन मैक्रोफेज से फोम सेल गठन के लिए प्रेरित फोम सेल गठन की । इन मॉडलों में प्रयोग किया जाता एलडीएल अक्सर गैर द्वारा ऑक्सीकरण-शारीरिक-प्रासंगिक प्रक्रियाओं जैसे CuSO4 उपचार17, इसलिए, इन मॉडलों का उपयोग कर अध्ययन के शारीरिक महत्व पर सवाल ।
यहां हम एक परख का वर्णन है कि quantifies monocyte स्थानांतरगमन और फोम कोशिका जो exogenous oxLDL के अलावा की आवश्यकता नहीं है एक ही कोशिकाओं के गठन, इस प्रकार फोम सेल गठन में monocytes की भूमिका बेहतर मॉडलिंग । इस मॉडल को मूल रूप से प्रोफेसर विलियम मुलर (पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय, शिकागो) द्वारा विकसित किया गया था18, और आगे के लिए हमारी प्रयोगशाला में परिष्कृत किया गया है का आकलन करने के लिए पूर्व vivo monocytes के atherogenicity गैर-सक्रिय के तहत पृथक अंतर्निहित भड़काऊ शर्तों के साथ व्यक्तियों से शर्तों एचआईवी संक्रमण के रूप में19 के रूप में अच्छी तरह से उंर बढ़ने के रूप में20, कि atherosclerosis का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं । यह मॉडल भी बुनियादी जैविक विभिंन monocyte उपसमुच्चय की प्रवृत्ति के बारे में जवाब के लिए एक मंच प्रदान करता है फोम कोशिकाओं के फार्म20, साइटोकिंस द्वारा endothelial सक्रियण के प्रभाव जैसे फोम सेल गठन पर TNF के रूप में14 , और monocytes के प्रवासी गुण जैसे कि जैल19में स्थानांतरगमन की गहराई और गति । इसके अलावा, monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन मानक माइक्रोस्कोपी, लाइव सेल इमेजिंग, प्रवाह cytometry और इमेजिंग प्रवाह cytometry, इसलिए, monocytes में atherogenesis की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक बहुमुखी विधि प्रदान करने का उपयोग कर मात्रा जा सकता है ।
Protocol
नोट: मानव जैविक नमूनों का उपयोग करते हुए सभी प्रयोगों अल्फ्रेड अस्पताल मानव नैतिकता समिति, मेलबोर्न से नैतिकता अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया । सभी प्रयोगों वर्ग द्वितीय सुरक्षा अलमारियां में प्?…
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित मानव नैदानिक साथियों से monocytes के atherogenicity का आकलन करने के लिए एक बहुमुखी और शारीरिक रूप से प्रासंगिक विधि प्रदान करता है, दोनों monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के संयोजन से । यह मॉडल फो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक आभार प्रो विलियम मुलर और डॉ क्लेयर Westhorpe इस मॉडल के पहले पुनरावृत्तियों के विकास में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए के काम को स्वीकार करते हैं । लेखक भी कुछ अध्ययनों के लिए एचआईवी + व्यक्तियों की भर्ती के लिए monocyte उपसमुच्चय और अल्फ्रेड अस्पताल संक्रामक रोग इकाई नैदानिक अनुसंधान नर्सों की छंटाई के लिए AMREP फ्लो Cytometry कोर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । लेखक कृतज्ञता Burnet संस्थान द्वारा प्राप्त विक्टोरिया संचालन अवसंरचना सहायता कार्यक्रम के इस कार्य में योगदान को स्वीकार करते हैं । ताा एक RMIT विश्वविद्यालय के कुलपति Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है । यह काम NHMRC परियोजना अनुदान ११०८७९२ अज और आह करने के लिए संमानित द्वारा समर्थित किया गया था । TK NIH अनुदान NIH K08AI08272, NIH/NCATS ग्रांट # UL1TR000124 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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