Vi beskriver en protokoll for å måle transmigration av monocytter over menneskelige endotelial monolayers og deres påfølgende modning i skum celler. Dette gir en allsidig metode å vurdere atherogenic egenskapene av monocytter isolert fra folk med ulike sykdom forhold og vurdere faktorer i blodet som kan forbedre denne tilbøyelighet.
Koronarsykdom (CAD) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Aterosklerose, en ledende årsak til DAK, startes av transmigration av medfødte immunforsvaret monocytter inflammatorisk områder av avsatt lipid kalt fet striper, som finnes i arterial vegger av middels til store arterier. De viktigste patogene funksjonen av lesjoner på dette tidlige stadium av aterosklerose er modning av monocytter som migrerer til arteriene å danne skum celler eller lipid-laden makrofager. Betydelige bevis støtter hypotesen at risikoen for åreforkalkning økes med kronisk opphissende vilkårene følger sykdommer som revmatoid artritt og HIV, i tillegg til de generelle aldring, og at denne risikoen er spådd av monocyte aktivisering. Musen modeller gir en god plattform for å undersøke rollen av monocytter i atherogenesis i vivo, de krever genetisk endring av naturlige kolesterol metabolismen og drastisk endring av normal mus dietter, og har begrenset egnethet for studiet av atherogenic påvirkninger av menneskelig komorbide sykdommer. Dette motivert oss å utvikle en menneskelig i vitro modell for å måle atherogenic potensialet av monocytter isolert fra personer med definerte sykdomstilstander. Foreløpig er menneskelige i vitro modeller begrensende i at de vurderer monocytt transmigration og skum celle formasjon i isolasjon. Her beskriver vi en protokoll som monocytter isolert fra pasientens blod transmigrate over menneskelige endotelceller i en type 1 kollagen matrise, og deres tilbøyelighet til å modne i skum celler i tilstedeværelse eller fravær av eksogene lipid måles. Protokollen er validert for bruk av menneskelige monocytter renset fra personer med HIV-infeksjon og eldre HIV infisert enkeltpersoner. Denne modellen er allsidig og lar monocytt transmigration og skum celle formasjon evalueres ved hjelp av enten mikroskopi eller flowcytometri så vel som tillater vurdering av atherogenic faktorer til stede i serum- eller.
Monocytt transmigration er et viktig skritt i utviklingen av aterosklerotisk plakk som kan føre til hjerteinfarkt, blodpropp og slag. Aterosklerotisk plaketter utvikle fra fet striper, generelt finnes på nettsteder av lav oscillasjon blodstrøm i middels til store arteriene, der avsatt lipid bidrar til endotelial aktivisering og lokalisert betennelse1. Monocytter er rekruttert til endotelceller i fet striper via monocyte chemotactic proteiner (for eksempel CCL2) og transmigrate i intima2. Etter transmigration, kan monocytter danne atherogenic, lipid-laden makrofager kalt skum celler av lipid opptak, lipid syntese, ned-regulering av kolesterol middelklasseinnbyggere eller en kombinasjon av de ovennevnte faktorene. Monocytter kan også samle lipider i sirkulasjon og har en “skummet” fenotype, muligens disponerer celler for skum celle formasjon3,4. Skum cellene er de definerende trekk ved fet striper og tidlig stadium aterosklerotisk plaketter og deres dannelse påvirkes av både lipid og inflammatoriske mediatorer5. Alternativt, monocytter har evnen til å reversere transmigrate fra arterien i blodet6, og dermed fjerne lipid fra intima og fungerende å opprettholde helsen til arterien.
Bestemme tilbøyelighet av monocytter å transmigrate over arteriell endotelet og skjemaet skum celler i intima eller reversere transmigrate og bære lipid av plakk, er viktig for forståelsen av monocyte aktivisering i økende aterosklerotisk risiko. Musen modeller av CADs som atherosclerosis er viktig i Klargjørende sanntid i vivo informasjon med fet strek/aterosklerotisk plakk utvikling. Disse modellene krever imidlertid en genetisk endring av naturlige kolesterol behandling evner av disse dyrene vanligvis kombinert med drastiske endringer i kosthold (for eksempel ApoE-/-Western-type diett modell)7,8, dermed inducing ikke-fysiologiske akkumulering av sirkulerende lipid nivåer der stasjon plakk utviklingen. Disse modellene kan ha begrenset relevans til kronisk inflammatorisk menneskelige forhold som HIV-infeksjon som ikke er forbundet med økt sirkulerende kolesterol eller lav tetthet lipoprotein (LDL) nivåer. Videre forskjeller i monocytt biologi mellom mennesker og mus gjør testing av immunologiske spørsmål om relevansen av subpopulasjoner av monocytter (som mellomliggende monocytter (CD14++CD16+))9 vanskelig. Dette er viktig når studere mekanismer kjøring kardiovaskulær sykdom som mellomliggende monocytt teller uavhengig forutsi hjerte hendelser10,11. Mens analyser eksisterer for å måle sekvensielt enten monocytt transmigration eller skum celle formasjon i isolasjon, er ingen i vitro analysen validert for kvantifisering både aspekter av tidlig atherogenesis bruker de samme cellene fra klinisk kohorter. Transwell modeller bruker en modifisert Boyden to-kammer system der celler er lastet inn i toppen kammeret og transmigrate over en porøs plast-barrieren eller celle monolayer i en lavere kammer som vanligvis inneholder medier med chemoattractant12 , 13. mens mye brukt for å analysere leukocytter transmigration, disse modellene ikke generelt inkorporere et lag som representerer intima, noe som resulterer i transmigrated cellene migrerer til løsning, og tillater ikke for måling av skum celle formasjon eller omvendt transmigration til de samme cellene. Derimot gjøre modeller av skum celle formasjon ikke rede for eventuelle transmigratory-indusert endringer monocytter eller effekter av endothelial aktivering som er kjent for å bidra til å skumme celle formasjon14. Videre disse systemene indusere skum celle formasjon fra makrofager overholdt celle kultur plater med tillegg av Mette konsentrasjoner av eksogene oksidert low-density lipoprotein (oxLDL)15,16, en nøkkel induser skum celle-formasjonen. LDL brukes i disse modellene er ofte oksidert av ikke-fysiologisk-relevante prosesser som CuSO4 behandling17, derfor avhør fysiologiske betydningen av studier med disse modellene.
Her beskriver vi en analyse som quantifies monocytt transmigration og skum celle dannelsen av de samme cellene som ikke krever tillegg av ytre oxLDL, dermed bedre modellering rollen av monocytter i skum celle formasjon. Denne modellen ble opprinnelig utviklet av Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, og har blitt ytterligere forbedret i vårt laboratorium å vurdere ex vivo atherogenicity av monocytter isolert under ikke-aktivering forhold fra personer med underliggende inflammatoriske tilstander følger sykdommer som HIV infeksjon19 samt aldring20, som er forbundet med økt risiko for åreforkalkning. Denne modellen gir også en plattform for å svare på grunnleggende biologisk spørsmål om tilbøyelighet av ulike monocytt delsett til skjemaet skum celler20, påvirkning av endothelial aktivering av cytokiner som TNF på skum celle formasjon14 , og vandrende egenskapene av monocytter som dyp og hastigheten på transmigration i gels19. Videre monocytt transmigration og skum celle formasjon kan kvantifiseres bruker standard mikroskopi, live celle bildebehandling, flow cytometri og bildebehandling flowcytometri, derfor gir en allsidig metode for å vurdere rollen av monocytter i atherogenesis.
Protokollen beskrevet her tilbyr en allsidig og fysiologisk relevante metode for å vurdere atherogenicity av monocytter fra menneskelige kliniske kohorter, ved å kombinere både monocytt transmigration og skum celle formasjon. Denne modellen har fordeler over alternativ metoder av skum celle formasjon som tar hensyn til effekten av monocyte transmigration på skum celle formasjon og lar måling av omvendt transmigration6 i tillegg til den iboende tilbøyelighet av monocytter å modne i skum cell…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner takknemlig arbeidet med Prof William Muller og Dr. Clare Westhorpe for sin viktige rolle i utviklingen av tidligere gjentakelser av denne modellen. Forfatterne vil også gjerne takke AMREP Flow cytometri kjernen for sorteringen av monocyte delsett og Alfred sykehus smittsom sykdom enheten klinisk forskning sykepleiere for rekruttering av HIV + individer for noen studier. Forfatterne erkjenner takknemlig bidrag til dette arbeidet Victoria operative infrastruktur støtteprogrammet mottatt av Burnet Institute. TAA støttes av en RMIT University-Visekanslers postdoktorstipend. Dette arbeidet ble støttet av NHMRC prosjekt stipend 1108792 tildelt AJ og AH. TK støttes av NIH gir NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Gel preparation reagents | |||
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopy | |||
1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry | |||
Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasticware | |||
96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |