Kvantifiering av monocyt själavandring och skum Cell Formation från individer med kroniska inflammatoriska sjukdomar

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att mäta transmigration av monocyter över mänskliga endothelial enskiktslager och deras efterföljande mognad i skumceller. Detta ger en mångsidig metod att bedöma de aterogena egenskaperna hos monocyter isolerade från personer med olika sjukdomstillstånd och utvärdera faktorer i blodet vilket kan öka denna benägenhet.

Abstract

Kranskärlssjukdom (CAD) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Åderförkalkning, en ledande orsaken till CAD, initieras av transmigrationen av medfödd immun monocyter till inflammatoriska webbplatser av deponerade lipid kallas feta streck, som finns i kärlväggarna av medelstora till stora artärer. Lesioner i detta tidiga skede av åderförkalkning patogena utomhusmiljö är mognaden av monocyter som migrerar in artärerna att bilda skumceller eller lipid-lastad makrofager. Betydande bevis stöder hypotesen att ökad risk för åderförkalkning av kroniska inflammatoriska sjukdomar som åtföljer sjukdomar såsom reumatoid artrit och HIV, samt allmänna åldrande och att denna risk förutspås av monocyt aktivering. Medan musmodeller ger en bra plattform för att undersöka betydelsen av monocyter i aterogenes i vivo, de kräver genetisk ändring av naturliga kolesterol metabolism och drastisk ändring av normal mus Dieter, och har begränsad lämplighet för studien av aterogena influenser av mänskliga samtidiga sjukdomar. Detta motiverade oss att utveckla en mänsklig in vitro- modell för att mäta aterogena potential av monocyter isolerade från individer med definierade sjukdomstillstånd. För närvarande begränsar mänsklig in vitro- modeller i att de utvärderar monocyt själavandring och skum cellnybildningen i isolering. Här beskriver vi ett protokoll där monocyter isolerade från patientens blod transmigrate över mänskliga endothelial celler till en typ 1 kollagenmatrisen, och deras benägenhet att mogna till skumceller i närvaro eller frånvaro av exogena lipid mäts. Protokollet har validerats för användning av humana monocyter renats från individer med HIV-infektion och äldre HIV infekterade individer. Denna modell är mångsidig och tillåter monocyt själavandring och skum cellbildande utvärderas med hjälp av antingen mikroskopi eller flödescytometri samt gör att bedömningen av aterogena faktorer förekommer i serum eller plasma.

Introduction

Monocyt själavandring är ett viktigt steg i utvecklingen av aterosklerotiska plack som kan leda till Trombos, stroke och hjärtinfarkt. Aterosklerotiska plack utvecklas från feta ränder, allmänhet närvarande vid platser av låg oscillerande blodflödet i medium till stora artärer, där deponerade lipid bidrar till endotel aktivering och lokaliserad inflammation¹. Monocyter rekryteras till endotelceller i feta streck via monocyt kemotaktisk proteiner (t.ex. CCL2) och transmigrate i den intima². Efter själavandring, kan monocyter bilda aterogena, lipid-lastad makrofager kallas skumceller till följd av lipid upptag, lipid syntes, down-förordning av kolesterol efflux eller en kombination av ovanstående faktorer. Monocyter kan även ackumuleras lipider i cirkulationen och har en ‘skummande’ fenotyp, möjligen predisponerande celler för skum cell bildning^3,4. Skummacellerna är definierande funktionen av feta ränder och tidigt stadium aterosklerotiska plack och prisbildningen påverkas av både lipid och inflammatoriska mediatorer⁵. Alternativt, monocyter har förmågan att vända transmigrate från artär i blodomloppet⁶, och tar därigenom bort lipid från intima och agerar för att bevara hälsan i artären.

Att bestämma propensityen av monocyter till transmigrate över arteriell endotel och bildar skumceller i intima eller att vända transmigrate och bära lipid av plack, är en viktig förutsättning för att förstå rollen av monocyt aktivering i ökande aterosklerotisk risk. Musmodeller av CADs såsom åderförkalkning är viktiga att belysa i realtid i vivo information om fatty streak/aterosklerotiska plack utveckling. Dessa modeller kräver dock en genetisk förändring av den naturliga kolesterol bearbetning förmågor av dessa djur oftast i kombination med drastiska förändringar i kost (såsom ApoE-/-Western-typ kost modell)^7,8, därmed, förmå icke-fysiologiskt ackumulering av cirkulerande lipid nivåer som driva plack utvecklingen. Dessa modeller kan ha begränsad relevans för kroniska inflammatoriska mänskliga sjukdomar såsom HIV-infektion som inte är associerade med ökad cirkulerande kolesterol eller low-density lipoprotein (LDL) nivåer. Dessutom skillnader i monocyt biologi mellan människor och möss gör testning av immunologiska frågor angående relevansen av subpopulationer av monocyter (såsom mellanliggande monocyter (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ svårt. Detta är viktigt när man studerar de mekanismer som driver hjärt-kärlsjukdom som mellanliggande monocyt räknas självständigt förutsäga kardiovaskulära händelser^10,11. Även analyser finns för att mäta sekventiellt antingen monocyt själavandring eller skum cellnybildningen i isolering, har inga in vitro- test validerats för att kvantifiera båda aspekter av tidig aterogenes med samma celler från kliniska kohorter. Transwell modeller använder en modifierad Boyden tvåkammarsystem där celler läses in den övre kammaren och transmigrate över en porös plast barriär eller cell enskiktslager i en nedre kammare som normalt innehåller media med korrektiv^{12 , 13}. samtidigt som ofta används för att analysera leukocyt själavandring, dessa modeller inte generellt införliva ett lager som representerar intima, vilket resulterar i livslopp cellerna migrerar till lösning, och Tillåt inte för mätning av skum cell bildning eller omvänd transmigration av samma celler. Modeller av skum-cellbildande däremot inte hänsyn till eventuella transmigratory-inducerad ändringar monocyter eller effekterna av endothelial aktivering som är kända för att bidra till att skum cell formation¹⁴. Dessutom dessa system inducera skum cell formation från makrofager följs cell kultur plattor av tillägg av mättar koncentrationer av exogena oxiderat LDL (oxLDL)^15,16, en nyckel inducerare foam cell bildas. LDL som används i dessa modeller är ofta oxideras av icke-fysiologiskt-relevanta processer såsom CuSO₄ behandling¹⁷, därför ifrågasätta den fysiologiska betydelsen av studier med hjälp av dessa modeller.

Här beskriver vi en analysmetod som kvantifierar monocyt själavandring och skum cell bildandet av samma celler som inte kräver tillsats av EXOGEN oxLDL, således bättre modellering rollen av monocyter i skum cell formation. Denna modell har ursprungligen utvecklats av Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸, och har varit förfinas ytterligare i vårt laboratorium att bedöma ex vivo atherogenicity av monocyter isolerade under icke-aktiverande villkor från individer med underliggande inflammatoriska tillstånd åtfölja sjukdomar såsom HIV infektion¹⁹ samt åldrande²⁰, som är associerade med en ökad risk för åderförkalkning. Denna modell ger också en plattform för att besvara grundläggande biologiska frågor angående benägenheten för olika monocyt delmängder till formuläret skum celler²⁰, påverkan av endothelial aktivering av cytokiner såsom TNF på skum-cellbildande¹⁴ , och flyttande egenskaperna av monocyter såsom djup och hastighet själavandring i geler¹⁹. Dessutom monocyt själavandring och skum cellbildande kan kvantifieras med standard mikroskopi, live cell imaging, flow flödescytometri och imaging flödescytometri, därför att ge en mångsidig metod för att utvärdera rollen av monocyter i aterogenes.

Protocol

Obs: alla experiment med mänskliga biologiska prover utfördes med etik godkännande från Alfred Hospital mänskliga etikkommittén, Melbourne. Alla experimenten utfördes i klass II biosäkerhet skåp såvida inte anges. " Prewarmed " refererar till reagenserna värmas till 37 ° C i ett vattenbad. 1. beredning av typ I fibrösa kollagen geler: dag 1 Förbered polymeriseras kollagen geler genom sekventiellt lägga till och blanda 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4.58 mM ättik…

Representative Results

Kvantifiera monocyt själavandring Monocyter läggs till modellen som beskrivs i figur 1och sex geler är förberedda för varje villkor. Monocyter för 6 geler per givare (dvs5,0 x 104 monocyter per gel 6 geler = 3,0 x 105 monocyter per givare) är resuspended till en slutlig volym av 600 µL av M199 media som innehåller den nödvändiga serum/isoler…

Discussion

Protokollet beskrivs här erbjuder en mångsidig och fysiologiskt relevanta metod för att bedöma atherogenicity av monocyter från mänskliga kliniska kohorter, genom att kombinera både monocyt själavandring och skum cellnybildningen. Denna modell erbjuder fördelar jämfört med alternativa metoder för skum-cellbildande eftersom det tar hänsyn till effekten av monocyt själavandring på skum cellnybildningen och tillåter mätning av omvänd själavandring⁶ utöver de inneboende benägenhet…

Materials

Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10X M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1X)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)