Summary

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Published: October 17, 2017
doi:

Summary

Descriviamo un protocollo per misurare trasmigrazione dai monociti attraverso strati monomolecolari endoteliali umani e la loro successiva maturazione in cellule della gomma piuma. Questo fornisce un metodo versatile per valutare le proprietà atherogenic dei monociti isolati da persone con diverse patologie e per valutare i fattori nel sangue che possono migliorare questa propensione.

Abstract

Malattia coronarica (CAD) è delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Aterosclerosi, dei principali causa di CAD, è iniziata dalla trasmigrazione dei monociti immune innati a siti infiammatori del lipido depositato chiamato strisce grasse, che sono presenti nelle pareti arteriose del mezzo alle grandi arterie. La caratteristica fondamentale di patogena delle lesioni in questa fase iniziale di aterosclerosi è la maturazione dei monociti che migrano nelle arterie per formare cellule schiumose o macrofagi lipido-carichi. La considerevole prova sostiene l’ipotesi che il rischio di aterosclerosi è aumentato di condizioni infiammatorie croniche, malattie come l’artrite reumatoide e l’HIV, come pure l’invecchiamento generale di accompagnamento, e che questo rischio è previsto da monocito attivazione. Mentre modelli murini di fornire una buona piattaforma per studiare il ruolo dei monociti nel atherogenesis in vivo, richiedono alterazione genetica del metabolismo del colesterolo naturali e drastica alterazione delle diete normali del topo e hanno limitato l’idoneità per lo studio delle influenze atherogenic di malattie umane del comorbid. Questo ci ha motivato a sviluppare un modello umano in vitro per misurare il potenziale atherogenic di monociti isolati da individui con Stati di malattia definita. Attualmente, modelli umani in vitro sono limitanti in quanto valutano la formazione delle cellule di monocito trasmigrazione e schiuma in isolamento. Qui descriviamo un protocollo in cui monociti isolati da sangue del paziente trasmigrano in cellule endoteliali umane in una matrice di collagene di tipo 1, e viene misurata la loro propensione a maturare in cellule della gomma piuma in presenza o assenza di esogena del lipido. Il protocollo è stato convalidato per l’uso dei monociti umani purificati da individui con infezione da HIV e individui anziani non infetti da HIV. Questo modello è versatile e permette la formazione di monocito trasmigrazione e schiuma delle cellule deve essere valutata usando sia la microscopia o citometria a flusso, nonché a consentire la valutazione dei fattori atherogenic presenti nel siero o plasma.

Introduction

Trasmigrazione del monocito è un passo cruciale nello sviluppo della placca aterosclerotica che può portare a trombosi, ictus e infarto miocardico. Le placche aterosclerotiche si sviluppano da strisce grasse, generalmente presente nei siti di flusso sanguigno oscillatorio basso in mezzo alle grandi arterie, dove depositato lipidica contribuisce all’attivazione endoteliale e localizzata infiammazione1. I monociti sono reclutati alle cellule endoteliali in strisce grasse tramite proteine chemiotattica del monocito (ad esempio CCL2) e trasmigrano nei intima2. A seguito di trasmigrazione, monociti possono formare i macrofagi atherogenic, lipido-carichi, chiamati cellule della schiuma in conseguenza l’assorbimento del lipido, sintesi del lipido, down-regulation di efflusso di colesterolo o una combinazione di fattori di cui sopra. I monociti possono anche accumulare lipidi nella circolazione e hanno un fenotipo ‘schiumoso’, possibilmente che predispongono le cellule per schiuma cellulare formazione3,4. Cellule della gomma piuma sono la caratteristica distintiva delle strisce grasse e placche aterosclerotiche fase iniziale e la loro formazione è influenzata da mediatori infiammatori5e del lipido. In alternativa, i monociti hanno la capacità di invertire trasmigrano dall’arteria nella circolazione sanguigna6, eliminando dei lipidi dalla biancheria intima e di agire per mantenere la salute dell’arteria.

Determinare la propensione dei monociti ad trasmigrano attraverso endotelio arterioso e formare cellule di schiuma nel intima o invertire trasmigrano e trasportano lipidi fuori la placca, sono un requisito fondamentale per comprendere il ruolo dell’attivazione del monocito in aumento rischio aterosclerotico. Modelli murini di CADs quali aterosclerosi sono importanti nel delucidamento in tempo reale in vivo informazioni sullo sviluppo di fatty streak/aterosclerotica della placca. Tuttavia, questi modelli richiedono un’alterazione genetica del colesterolo naturale abilità di questi animali solitamente accoppiati con drastiche modifiche nella dieta (ad esempio il modello di dieta di ApoE-/-Western-tipo)7,8, quindi, di elaborazione induzione non fisiologico accumulo di lipidi di circolazione livelli quali lo sviluppo della placca di unità. Questi modelli possono avere limitate rilevanza a condizioni umane infiammatorie croniche quali l’infezione da HIV che non sono associate con aumentato di circolazione colesterolo o livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL). Inoltre, le differenze nella biologia del monocito tra esseri umani e topi fanno il test immunologico domande per quanto riguarda la pertinenza delle sottopopolazioni dei monociti (ad esempio intermedi monociti (CD14 ++CD16+))9 difficile. Questo è importante quando si studia i meccanismi che guidano la malattia cardiovascolare come intermedio del monocito conteggi predicono indipendente eventi cardiovascolari10,11. Mentre le analisi esistono per misurare in modo sequenziale o formazione di cellule monocito trasmigrazione o schiuma in isolamento, nessun test in vitro è stato convalidato per quantificare sia gli aspetti di atherogenesis iniziale utilizzando le stesse cellule da coorti cliniche. Transwell modelli utilizzano un sistema a doppia camera Boyden modificato per cui le cellule vengono caricati in camera superiore e trasmigrano attraverso una barriera di plastica porosa o monostrato di cellule in un alloggiamento più basso che in genere contiene supporto con chemoattractant12 , 13. mentre ampiamente usato per l’analisi di trasmigrazione leucocitaria, questi modelli non prevedono in genere un layer che rappresenta l’intima, con conseguente transmigrated cellule migrano in soluzione e non consentono la misurazione della cella di schiuma formazione o inversa trasmigrazione delle stesse cellule. Al contrario, modelli di formazione delle cellule della gomma piuma non conto di eventuali cambiamenti indotti da trasmigrazione di monociti o degli effetti dell’attivazione endoteliale che è conosciuto per contribuire a schiuma cellulare formazione14. Inoltre, questi sistemi inducono schiuma formazione delle cellule dai macrofagi aderito a piastre per colture cellulari con l’aggiunta di saturare le concentrazioni di esogeno lipoproteina a bassa densità ossidata (oxLDL)15,16, un induttore chiave di formazione delle cellule della gomma piuma. LDL utilizzato in questi modelli è spesso ossidato da processi non fisiologicamente rilevanti come CuSO4 trattamento17, quindi, mettere in discussione l’importanza fisiologica degli studi facendo uso di questi modelli.

Qui descriviamo un’analisi che quantifica la trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma delle stesse cellule che non richiede l’aggiunta di oxLDL esogeno, così meglio modellare il ruolo dei monociti nella formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello è stato originariamente sviluppato dal Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18ed è stata ulteriormente perfezionato nel nostro laboratorio per valutare ex vivo il atherogenicity dei monociti isolati sotto non attivazione condizioni da individui con patologie infiammatorie che accompagna malattie come HIV infezione19 così come invecchiamento20, che sono associati con un rischio aumentato di aterosclerosi. Questo modello offre anche una piattaforma per rispondere alle domande biologiche di base per quanto riguarda la propensione dei sottoinsiemi diversi del monocito a forma schiuma cellule20, l’influenza dell’attivazione endoteliale da citochine come TNF su formazione delle cellule della gomma piuma14 e le proprietà migratori dei monociti come la profondità e velocità di trasmigrazione in gel19. Inoltre, la formazione delle cellule di trasmigrazione e schiuma di monociti può essere quantificata utilizzando la microscopia standard, cella immagini dal vivo, flusso cytometry e imaging citometria a flusso, di conseguenza, fornendo un metodo versatile per valutare il ruolo dei monociti nel atherogenesis.

Protocol

Nota: tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con approvazione etica dal comitato di etica umana Alfred Hospital, Melbourne. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in armadi di sicurezza biologica di classe II se non diversamente specificato. " Prewarmed " si riferisce ai reagenti riscaldati a 37 ° C in bagnomaria. 1. preparazione di tipo I gel del collagene fibroso: giorno 1 preparare polimerizzato il gel del collagene in sequenza…

Representative Results

Quantificare la trasmigrazione del monocito Monociti vengono aggiunti al modello come descritto in Figura 1, e sei gel sono preparati per ogni condizione. Monociti per 6 gel per donatore (cioè, 5,0 x 104 monociti al gel gel 6 = 3.0 x 105 monociti per donatore) sono risospese ad un volume finale di 600 µ l di M199 supporti contenenti il lipido richies…

Discussion

Il protocollo descritto qui offre un metodo versatile e fisiologicamente rilevante per valutare il atherogenicity dei monociti da coorti cliniche umane, combinando sia trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello offre vantaggi rispetto ai metodi alternativi di formazione delle cellule della gomma piuma in quanto prende in considerazione l’effetto della trasmigrazione del monocito su formazione delle cellule della gomma piuma e consente la misurazione di trasmigrazione inversa<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine l’opera del professor William Muller e Dr. Clare Westhorpe per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. Gli autori inoltre vorrei ringraziare il nucleo AMREP citometria a flusso per lo smistamento dei monociti sottoinsiemi e l’Alfred Hospital infettiva malattia unità cliniche infermieri per l’assunzione di persone HIV + per alcuni studi di ricerca. Gli autori riconoscono con gratitudine il contributo a questo lavoro del Victoria programma operativo di infrastruttura di supporto ricevuto dall’Istituto Burnet. TAA è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. Quest’opera è stata sostenuta da NHMRC progetto sovvenzione 1108792 assegnato a AJ e AH. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # UL1TR000124.

Materials

Gel preparation reagents
NaOH Sigma-Aldrich 221465-500G 0.1 M NaOH diluted in H20
10X M199 Sigma-Aldrich M0650
AcCOOH Sigma-Aldrich 695092-100ML 20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I R&D Systems 3442-050-01 Type I Fibrous Collagen
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
M199 Life Technologies 11150-059 M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.
Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin 
M20 Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.
Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA BDH Merck 10093.5V Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0
EGTA Sigma-Aldrich E3889-500G Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA Gibco 25300-054 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine Gibco 25030-081 L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin  Gibco 15140-122 Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum Gibco 16010-142 New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin Sigma-Aldrich F1056-1MG Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1X) Gibco 14200-075 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20
0.1% TNF Gibco PHC3015 Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein Merck Millipore LP2-2MG Low-density lipoprotein (LDL)
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde Polysciences 4018 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol Ajax Finechem 318-2.5L GL 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain Sigma-Aldrich O0625-25G Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides Mikro-Glass S41104AMK Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips Menzel-Gläser MENCS224015GP 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape 3M Scotch 4011 Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain Merck Millipore 1.09204.0500 Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry
Collagenase D Roche Diagnostics 11088858001 Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL 
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes BD Biosciences 352235 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain Life Technologies L34959 Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash Prepare by mixing 1 X PBS, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96 well plate Nunclon 167008 Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish TPP 93100 Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150 Eppendorf tubes
Transfer pipette Samco Scientific 222-20S Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)

References

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Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Maisa, A., Kelesidis, T., Jaworowski, A. Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions. J. Vis. Exp. (128), e56293, doi:10.3791/56293 (2017).

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