In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen
Summary
Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.
Abstract
Mitochondriën zijn de krachtpatsers van cellen en cellulaire energie in de vorm van ATP produceren. Mitochondriale dysfunctie bijdraagt aan biologische veroudering en een breed scala aan aandoeningen waaronder neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), metabole ziekten en voortijdige veroudering syndromen. Onderhoud van mitochondriale gezondheid hangt af van mitochondriale biogenese en de efficiënte goedkeuring van disfunctionele mitochondria via mitophagy. Experimentele methoden te nauwkeurig detecteren autophagy/mitophagy, met name in diermodellen, hebben zijn uitdagend om te ontwikkelen. Recente vooruitgang op weg naar het begrip van de moleculaire mechanismen van mitophagy heeft de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken ingeschakeld. Hier introduceren we verschillende veelzijdige technieken voor het controleren van mitophagy in menselijke cellen, Caenorhabditis elegans (bijvoorbeeldRosella en DCT-1 / LGG-1 stammen), en muizen (mt-Keima). Een combinatie van deze mitophagy detectietechnieken, met inbegrip van cross-soorten evaluatie, zal de nauwkeurigheid van de metingen van de mitophagy verbeteren en leiden tot een beter begrip van de rol van mitophagy bij gezondheid en ziekte.
Introduction
Mitophagy is essentieel voor mitochondriale onderhoud. Mitochondriën kruisen meerdere cel signalering van trajecten en zijn universele sub cellulaire organellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire energieproductie, celstofwisseling en calcium homeostase1,2,3, 4. mitochondria voortdurend ervaring uitdagingen van endogene en exogene bronnen, zoals reactieve zuurstof soorten (ROS) en toxische stoffen in het mitochondriale, respectievelijk, die leiden tot de generatie van “leeftijd” en disfunctionele mitochondriën. Accumulatie van beschadigde mitochondriën verlaagt de efficiëntie van de ATP productie terwijl het verhogen van de hoeveelheid schadelijke ROS, en is gekoppeld aan de leeftijd gerelateerde ziekten zoals metabole ziekten, AD, en PD1,5,6 . Om te voorkomen dat mitochondriën geïnduceerde cellulaire dysfunctie, cellen moeten specifiek herkennen beschadigd mitochondriën en efficiënt verwijderen hen via een cellulaire proces genoemd mitochondriale autophagy (mitophagy). Dit toonde het belang aan van mitophagy in gezondheid en ziekte illustreert de behoefte aan nauwkeurige en efficiënte methoden voor het detecteren van mitophagy zowel in vitro als in vivo.
Mitophagy is een proces van meerdere stappen waarbij veel eiwitten en eiwit complexen5,7,8. Kortom, wordt een beschadigde mitochondrion eerst herkend en opgeslokt door een dubbel-membraned phagophore, die afkomstig van het plasmamembraan, endoplasmatisch reticulum, Golgi-complex, nucleus of mitochondrion zelf9,10 zijn kan. De sferische phagophore kieuwopeningenvorm en uiteindelijk zeehonden de mitochondriën binnen, vormen de mitochondriale autophagosome (mitophagosome). De mitophagosome combineert vervolgens met het lysosoom voor afbraak, vorming van een autolysosome waarin de beschadigde mitochondrion aangetast en gerecycleerde7,8 is. Grote autophagic eiwitten ook betrokken bij mitophagy omvatten: Autophagy verwante 7 (ATG7) en Beclin1 (initiatie), Microtubule-Associated eiwit 1A/1B-Light ketting 3 (LC3-II) (LGG-1 in C. elegans) en p62 (onderdelen van phagophore), en Lysosomale-geassocieerde membraan glycoproteïne 2 (LAMP2)6,7. Daarnaast zijn er verschillende essentiële eiwitten uniek voor mitophagy, met inbegrip van PTEN-geïnduceerde putatief Kinase 1 (roze-1), Parkin1, nucleaire Dot eiwit 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interactie eiwit 3 zoals (NIX/BNIP3L) (DCT-1 in C. elegans), o.a.5,6,11.
Een gemeenschappelijke methode voor de opsporing van wijzigingen in niveaus van autophagy is door de verhouding tussen LC3-II/LC3-I of LC3-II/actine. Deze methode is echter niet-specifieke, zoals een toename van deze verhouding kan een verhoogde initiatie of een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan samensmelting van mitophagosome en lysosoom12weerspiegelen. Een andere methode is het evalueren van de colocalization tussen een autophagy marker (bijvoorbeeldLC3) en een mitochondriale eiwit (bijvoorbeeldTranslocase van buitenste mitochondriale membraan 20 (TOMM20, die kan worden afgebroken door Proteasomen)). Echter, dit kan alleen veranderingen in de totale mitophagy aangeven en kan geen onderscheid maken de stappen welke blokkade optreedt. Dit kan worden verduidelijkt met behulp van lysosomale remmers (bijvoorbeeld, E64d + Pepstatin A, zogenaamde EP) parallel aan de accumulatie van mitophagosomes veroorzaken. Het verschil tussen het aantal mitophagosomes op de basislijn en het aantal mitophagosomes na behandeling met EP kan duiden op mitophagy. Deze beperkingen hebben gevraagd de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken. Met het oog op de toenemende relevantie van mitophagy in een breed spectrum van ziekten bij de mens presenteren wij verschillende robuuste mitophagy detectietechnieken die nuttig voor onderzoekers zijn kunnen. Wij dekken zowel in vitro als in vivo technieken en adviseren combineren meerdere technieken om te controleren of de wijzigingen van de mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurige meting van mitophagy is technisch veeleisend. Hier hebben wij diverse robuuste technieken waarmee beide kwalitatieve detectie van mitophagy en kwantificering van mitophagy niveaus in de meest voorkomende laboratorium experimentele modellen gepresenteerd.
Repliceerbaar om gegevens te vergaren, een experimenteel ontwerp met ten minste drie biologische herhalingen nodig is. Alle onderzoekers die betrokken zijn bij experimenten en de analyse moeten worden verblind experimentele groep i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Atsushi Miyawaki en Dr. Richard J. Youle voor het delen van de plasmide mt-Keima en mt-Keima geïntegreerd Hela cellen. Wij danken Raghavendra A. Shamanna en Dr Deborah L. Croteau voor de kritische lezing van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH (VAB), verlenen National Institute on vergrijzing, evenals een 2014-2015 en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EVF, VAB). EVF werd gesteund door HELSE SOR-OST RHF (Project No: 2017056) en het onderzoek Raad Noorwegen (Project No: 262175).
AUTEUR BIJDRAGEN:
EVF ontworpen het manuscript en het ontwerp; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH en ED schreef verschillende secties van het papier; NT, JP, HN en VAB herziene versie van het manuscript en voorzien van deskundigheid.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
