इन विट्रो में और Vivo में मानव कोशिकाओं में Mitophagy का पता लगाने, सी. एलिगेंस, और चूहों
Summary
Mitophagy, क्षतिग्रस्त mitochondria समाशोधन की प्रक्रिया, mitochondrial homeostasis और स्वास्थ्य के रखरखाव के लिए आवश्यक है । यह आलेख मानव कोशिकाओं, Caenorhabditis एलिगेंस, और चूहों में नवीनतम mitophagy डिटेक्शन तरीकों में से कुछ प्रस्तुत करता है ।
Abstract
Mitochondria कोशिकाओं के बिजलीघरों और एटीपी के रूप में सेलुलर ऊर्जा का उत्पादन कर रहे हैं । Mitochondrial शिथिलता जैविक उम्र बढ़ने के लिए योगदान देता है और चयापचय रोगों सहित विकारों की एक विस्तृत विविधता, समय से पहले उम्र बढ़ने सिंड्रोम, और अल्जाइमर रोग (AD) और पार्किंसंस रोग (पीडी) जैसे neurodegenerative रोगों. mitochondrial स्वास्थ्य का अनुरक्षण mitochondrial उत्पत्ति और mitophagy के माध्यम से बेकार mitochondria के कुशल निकासी पर निर्भर करता है । विशेष रूप से पशु मॉडलों में autophagy/mitophagy का पता लगाने के लिए प्रयोगात्मक तरीके, विकसित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । mitophagy के आणविक तंत्र की समझ की दिशा में हाल ही में प्रगति उपंयास mitophagy का पता लगाने तकनीकों के विकास को सक्षम किया गया है । यहां, हम मानव कोशिकाओं, Caenorhabditis एलिगेंस (जैसे, Rosella और डीसीटी-1/रेनिन-1 उपभेदों), और चूहों (मीट्रिक टन-Keima) में mitophagy की निगरानी करने के लिए कई बहुमुखी तकनीक का परिचय । क्रॉस प्रजातियों के मूल्यांकन सहित इन mitophagy का पता लगाने तकनीक का एक संयोजन, mitophagy माप की सटीकता में सुधार होगा और स्वास्थ्य और रोग में mitophagy की भूमिका की एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व.
Introduction
mitochondrial के रखरखाव के लिए Mitophagy जरूरी है । Mitochondria एकाधिक सेल संकेतन मार्ग काटना और यूनिवर्सल उप सेलुलर organelles सेलुलर ऊर्जा उत्पादन के लिए जिंमेदार हैं, सेल चयापचय, और कैल्शियम homeostasis1,2,3, 4. Mitochondria लगातार अंतर्जात और exogenous स्रोतों, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) और mitochondrial विषालु, क्रमशः, जो “वृद्ध” और बेकारी Mitochondria की पीढ़ी के लिए नेतृत्व से चुनौतियों का अनुभव । क्षतिग्रस्त mitochondria के संचय एटीपी उत्पादन की दक्षता कम हो जाती है, जबकि हानिकारक ROS की मात्रा में वृद्धि, और चयापचय रोगों, विज्ञापन के रूप में उम्र से संबंधित रोगों से जोड़ा गया है, और पीडी1,5,6 . mitochondria प्रेरित सेलुलर रोग को रोकने के लिए, कोशिकाओं को विशेष रूप से क्षतिग्रस्त mitochondria पहचान और कुशलतापूर्वक एक सेलुलर प्रक्रिया के माध्यम से उंहें हटाने की जरूरत mitochondrial autophagy (mitophagy) । यह स्वास्थ्य और रोग में mitophagy का प्रदर्शन महत्व सटीक और कुशल तरीकों दोनों विट्रो में और vivo मेंmitophagy का पता लगाने के लिए की जरूरत है दिखाता है ।
Mitophagy कई प्रोटीन और प्रोटीन कॉंप्लेक्स5,7,8शामिल है एक बहु कदम प्रक्रिया है । संक्षेप में, एक क्षतिग्रस्त mitochondrion पहले पहचाना और एक डबल-झिल्ली phagophore, जो प्लाज्मा झिल्ली, endoplasmic जालिका, Golgi परिसर, नाभिक, या mitochondrion ही9,10से उत्पन्न कर सकते हैं द्वारा घिरा हुआ है । गोलाकार phagophore लंबी और अंततः mitochondria के अंदर जवानों, mitochondrial autophagosome (mitophagosome) का गठन । mitophagosome तो क्षरण के लिए lysosome के साथ फ़्यूज़, एक autolysosome है जिसमें क्षतिग्रस्त mitochondrion नीचा और पुनर्नवीनीकरण है गठन7,8। mitophagy में शामिल प्रमुख autophagic प्रोटीन भी शामिल हैं: Autophagy संबंधित 7 (ATG7) और Beclin1 (दीक्षा), Microtubule-एसोसिएटेड प्रोटीन 1a/1b-लाइट चेन 3 (LC3-II) (रेनिन-1 में C. elegans) और p62 (phagophore के अवयव), और लाइसोसोमल-एसोसिएटेड झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन २ (LAMP2)६,७. इसके अलावा, mitophagy के लिए अद्वितीय कई आवश्यक प्रोटीन्स हैं, जिनमें PTEN-प्रेरित ख्यात कळेनासे 1 (पिंक-1), Parkin1, न्यूक्लियर डॉट प्रोटीन ५२ केडीए (NDP52), optineurin, BCL2 इंटरैक्ट प्रोटीन 3 जैसे (इंकार/BNIP3L) (डीसीटी-1 in C. एलिगेंस), अंय लोगों के अलावा5,6,11।
autophagy के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक आम विधि LC3-ii/LC3-I या LC3-ii/actin के अनुपात से है । हालांकि, इस विधि विशिष्ट है, इस अनुपात में वृद्धि के रूप में या तो एक वृद्धि की दीक्षा या mitophagosome के एक बिगड़ा फ्यूजन को प्रतिबिंबित कर सकते है lysosome12। एक अन्य विधि एक autophagy मार्कर के बीच colocalization का मूल्यांकन करने के लिए है (जैसे, LC3) और एक mitochondrial प्रोटीन (जैसे, बाहरी Translocase झिल्ली की mitochondrial 20 (TOMM20, जो proteasomes द्वारा नीचा किया जा सकता है)). हालांकि, यह केवल कुल mitophagy स्तर में परिवर्तन का संकेत कर सकते है और जो रुकावट होती है चरण (s) भेद नहीं कर सकता । यह लाइसोसोमल अवरोधकों का उपयोग करके स्पष्ट किया जा सकता है (उदा., E64d + Pepstatin एक, mitophagosomes के संचय के कारण समानांतर में EP) । आधार रेखा पर mitophagosomes की संख्या और mitophagosomes की संख्या के बीच अंतर EP के साथ उपचार के बाद mitophagy संकेत कर सकते हैं । इन सीमाओं ने उपन्यास mitophagy डिटेक्शन तकनीक के विकास का संकेत दिया है. मानव रोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में mitophagy की बढ़ती प्रासंगिकता को ध्यान में रखते हुए, हम शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है जो कई मजबूत mitophagy का पता लगाने तकनीक वर्तमान. हम दोनों में इन विट्रो और vivo तकनीकों में कवर और mitophagy के परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए कई तकनीकों के संयोजन की सिफारिश ।
Protocol
Representative Results
Discussion
mitophagy का सटीक माप तकनीकी रूप से मांग कर रहा है । यहां, हम कई मजबूत तकनीक है जो mitophagy और सबसे आम प्रयोगशाला प्रयोगात्मक मॉडल में mitophagy स्तर के ठहराव के दोनों गुणात्मक पता लगाने के लिए अनुमति प्रस्तुत किया है ।
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एमटी-Keima प्लाज्मिड और एमटी-Keima एकीकृत हेला कोशिकाओं को बांटने के लिए डॉ॰ अतसुशी Miyawaki और डॉ॰ रिचर्ड जे Youle का धन्यवाद करते हैं । हम राघवेंद्र ए Shamanna और डॉ दबोरा एल Croteau पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धंयवाद । इस शोध को NIH (VAB), वृद्धावस्था पर राष्ट्रीय संस्थान के अंदर रिसर्च प्रोग्राम के साथ-साथ एक 2014-2015 और 2016-2017 निया अंतरराज्यीय प्रयोगशाला अनुदान (EFF, VAB) द्वारा समर्थित किया गया. EFF HELSE SOR द्वारा समर्थित था-OST RHF (परियोजना नहीं: २०१७०५६) और नॉर्वे के अनुसंधान परिषद (परियोजना नहीं: २६२१७५) ।
लेखक योगदान:
EFF पांडुलिपि डिजाइन और मसौदा तैयार किया; केपी, एनएस, EMF, आरडीएस, JSK, सैक, YH, और ईडी ने कागज के विभिन्न वर्गों को लिखा; NT, जेपी, हेमवती, और VAB पांडुलिपि संशोधित और विशेषज्ञता प्रदान की है ।
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
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