In Vitro og i Vivo oppdagelse av Mitophagy i menneskelige celler, C. Elegansog mus
Summary
Mitophagy, prosessen med å fjerne skadet mitokondrier, er nødvendig for mitokondrie homeostase og helse vedlikehold. Denne artikkelen presenterer noen av de nyeste mitophagy gjenkjenningsmetoder i menneskelige celler, Caenorhabditis elegansog mus.
Abstract
Mitokondrier er kraftstasjoner celler og produserer cellular energi i form av ATP. Mitokondrielt dysfunksjon bidrar til biologisk aldring og en rekke lidelser inkludert metabolske sykdommer, tidlig aldring syndromer og nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD) og Parkinsons sykdom (PD). Vedlikehold av mitokondrie helse avhenger av mitokondrie biogenesis og effektiv rydding av dysfunksjonelle mitokondriene gjennom mitophagy. Eksperimentelle metoder for å nøyaktig oppdage autophagy/mitophagy, spesielt i dyremodeller, har vært utfordrende for å utvikle. Framskritt mot forståelsen av molekylære mekanismer av mitophagy har aktivert utviklingen av romanen mitophagy teknikker. Her introduserer vi flere allsidig teknikker for å overvåke mitophagy i menneskelige celler, Caenorhabditis elegans (f.eksRosella og DCT-1 / LGG-1 stammer), og mus (mt-Keima). En kombinasjon av disse mitophagy teknikker, inkludert cross-species evaluering, vil forbedre nøyaktigheten av mitophagy mål og føre til en bedre forståelse av rollen mitophagy i helse og sykdom.
Introduction
Mitophagy er viktig for mitokondrie vedlikehold. Mitokondrier overlappe flere celle signalnettverk trasé og er universell sub mobilnettet organelles ansvarlig for cellular energiproduksjon, celle metabolisme og kalsium homeostase1,2,3, 4. mitokondrier stadig oppleve utfordringer fra endogene og eksogene kilder, for eksempel reaktive oksygen arter (ROS) og mitokondrie giftstoffer, henholdsvis som føre til generering av “eldre” og dysfunksjonelle mitokondriene. Akkumulering av skadet mitokondrier reduserer effektiviteten i ATP produksjon mens økende mengden av skadelige ROS, og har vært knyttet til alder-relaterte sykdommer som metabolske sykdommer, annonse, og PD1,5,6 . For å hindre mitokondrier indusert mobilnettet dysfunction, kalt cellene, må spesifikt gjenkjenne skadet mitokondrier og effektivt fjerne dem gjennom en mobilnettet mitokondrie autophagy (mitophagy). Dette demonstrerte betydningen av mitophagy i helse og sykdom illustrerer behovet for nøyaktige og effektive metoder for å oppdage mitophagy både i vitro og i vivo.
Mitophagy er en flertrinns prosess som involverer mange proteiner og protein komplekser5,7,8. I korte trekk en skadet mitokondrie først gjenkjennes og omsluttet av en dobbel-membraned phagophore, som kan stammer fra plasma membran, endoplasmatiske retikulum, Golgi komplekset, kjernen eller mitokondrie selv9,10. Sfærisk phagophore elongates og til slutt sel mitokondrier inne, utgjør den mitokondrie autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome deretter sikringer med lysosome til fornedrelse, danner en autolysosome der skadet mitokondrie er degradert og resirkulert7,8. Store autophagic proteiner også involvert i mitophagy inkluderer: Autophagy relaterte 7 (ATG7) og Beclin1 (initiering), Microtubule-Associated Protein 1A/1B-lys kjeden 3 (LC3-II) (LGG-1 i C. elegans) og p62 (komponenter av phagophore), og lysosomale-assosiert membran glykoprotein 2 (LAMP2)6,7. I tillegg er det flere essensielle proteiner unike for mitophagy, inkludert PTEN-indusert antatte Kinase 1 (rosa-1), Parkin1, kjernefysiske Dot Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 samspill Protein 3 som (NIX/BNIP3L) (DCT-1 i C. elegans), blant andre5,6,11.
En vanlig metode å oppdage endringer i nivåer av autophagy er av forholdet mellom LC3-II/LC3-I eller LC3-II/utgangen. Men er denne metoden uspesifikke, som en økning i dette forholdet kan gjenspeile en økt innvielse eller en svekket fusjon av mitophagosome til lysosome12. En annen metode er å evaluere colocalization mellom en autophagy markør (f.eksLC3) og en mitokondrie protein (f.eksTranslocase av ytre mitokondrie membran 20 (TOMM20, som kan reduseres ved proteasomes)). Men dette kan bare angi endringer i totalt mitophagy nivåer og ikke kan skille fremgangsmåten som blokkering oppstår. Dette kan bli avklart ved hjelp av lysosomale hemmere (f.eksE64d + Pepstatin A, kalt EP) parallelt til Oppsamling av mitophagosomes. Forskjellen mellom antall mitophagosomes ved baseline og antall mitophagosomes etter behandling med EP kan indikere mitophagy. Disse begrensningene har bedt om utviklingen av romanen mitophagy teknikker. I lys av økende relevansen av mitophagy i et bredt spekter av menneskelige sykdommer presenterer vi flere robust mitophagy teknikker som kan være nyttig for forskerne. Vi dekker både i vitro og vivo teknikker og anbefaler kombinere flere teknikker for å bekrefte endringene i mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nøyaktig måling av mitophagy er teknisk krevende. Her har vi presentert flere robust teknikker som tillater begge kvalitativ påvisning av mitophagy og måling av mitophagy i de vanligste laboratorium eksperimentelle modellene.
For å erverve repliserbare data, er en eksperimentell design med minst tre biologiske gjentakelser nødvendig. Alle forskere involvert i eksperimentering og analyse må være blinde for forsøksgruppen identiteter. Videre må imaging felt være tilfeldig valgt under …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Atsushi Miyawaki og Dr. Richard J. Youle for deling av mt-Keima plasmider og mt-Keima integrert Hela celler. Vi takker Raghavendra A. Shamanna og Dr. Deborah L. Croteau for kritisk lesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av NIH (VAB), gi National Institute on aldring, samt en 2014-2015 og et 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EFF, VAB). EFF ble støttet av HELSE Sør-OST RHF (Project No: 2017056) og av Norges forskningsråd (Project No: 262175).
FORFATTER BIDRAG:
EFF designet manuskriptet og forberedt på utkastet; KP, NS, EMF, RDS, JSKS, SAC, YH og ED skrev ulike deler av på papiret. NT, JP, HN og VAB reviderte manuskriptet og gitt kompetanse.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
