In Vitro och In Vivo upptäckt av Mitophagy i mänskliga celler, C. Elegansoch möss
Summary
Mitophagy, processen för clearing skadade mitokondrier, är nödvändigt för mitokondriell homeostas och hälsa underhåll. I denna artikel presenteras några av de senaste mitophagy identifieringsmetoder i mänskliga celler, Caenorhabditis elegansoch möss.
Abstract
Mitokondrierna är kraftcentrumen av celler och producera cellulär energi i form av ATP. Mitokondriell dysfunktion bidrar till biologiska åldrande och en mängd olika sjukdomar inklusive metabola sjukdomar, för tidigt åldrande syndrom och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD). Underhåll av mitokondriell hälsa beror på mitokondriell biogenes och effektivt clearance av dysfunktionella mitokondrier genom mitophagy. Experimentella metoder för att upptäcka autofagi/mitophagy, särskilt i djurmodeller, har varit en utmaning för att utveckla. Senaste framsteg mot förståelsen av molekylära mekanismer för mitophagy har möjliggjort utvecklingen av Roman mitophagy detekteringsmetoder. Här, vi införa flera mångsidiga tekniker för att övervaka mitophagy i mänskliga celler, Caenorhabditis elegans (t.ex., Rosella och DCT-1 / LGG-1 stammar), och möss (mt-Keima). En kombination av dessa mitophagy detekteringsmetoder, inklusive mellan djurarter utvärdering, kommer att förbättra noggrannheten av mitophagy mätningar och leda till en bättre förståelse av rollen som mitophagy i hälsa och sjukdom.
Introduction
Mitophagy är viktigt för mitokondriell underhåll. Mitokondrier skär flera cell signalering vägar och är universella sub cellulära organeller ansvarar för cellernas energiproduktion, cellernas ämnesomsättning och kalcium homeostasen1,2,3, 4. mitokondrier ständigt uppleva utmaningar från endogena och exogena källor, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) och mitokondrie gifter, respektive, som leda till generation av ”åldern” och dysfunktionella mitokondrier. Ansamling av skadade mitokondrier minskar effektiviteten i ATP produktionen samtidigt öka mängden skadliga ROS och har kopplats till åldersrelaterade sjukdomar såsom metabola sjukdomar, AD, och PD1,5,6 . För att förhindra mitokondrier inducerad cellulär dysfunktion, kallas celler behöver särskilt erkänna skadade mitokondrier och effektivt ta bort dem genom en cellulär process mitokondriell autofagi (mitophagy). Detta visade betydelsen av mitophagy i hälsa och sjukdom illustrerar behovet av korrekta och effektiva metoder för att upptäcka mitophagy både in vitro- och in vivo.
Mitophagy är en process i flera steg som innefattar många proteiner och protein komplex5,7,8. I korthet är en skadad mitokondrien först erkänt och uppslukas av en dubbel-membraned phagophore, som kan härröra från den plasmamembran, endoplasmatiska nätverket, Golgi komplexet, kärnan eller mitokondrien själv9,10. Den sfäriska phagophore förlänger och så småningom förseglar mitokondrierna inuti, som utgör den mitokondriella autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome sedan säkringar med Lysosomen för nedbrytning, bildar en autolysosome där den skadade mitokondrien är degraderad och återvunnet7,8. Stora autophagic proteiner också involverade i mitophagy inkluderar: autofagi relaterade 7 (ATG7) och Beclin1 (initiering) Microtubule-Associated Protein 1A/1B-Light kedja 3 (LC3-II) (LGG-1 i C. elegans) och p62 (komponenter av phagophore), och lysosomala-associerade membran glykoprotein 2 (LAMP2)6,7. Dessutom finns det flera viktiga proteiner som är unika för mitophagy, inklusive PTEN-inducerad förmodad Kinase 1 (rosa-1), Parkin1, Nuclear Dot Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interagerar Protein 3 som (NIX/BNIP3L) (DCT-1 i C. elegans), bland annat5,6,11.
En vanlig metod att upptäcka förändringar i nivåer av autofagi är av förhållandet mellan LC3-II/LC3-I eller LC3-II/aktin. Denna metod är dock ospecifik, eftersom en ökning av detta förhållande kan återspegla en ökad initiation eller en nedsatt fusion av mitophagosome till Lysosomen12. En annan metod är att utvärdera colocalization mellan en autofagi-markör (t.ex., LC3) och en mitokondriell protein (t.ex., Translocase av yttre mitokondriella membranet 20 (TOMM20, som kan brytas ned av proteasomen)). Dock detta endast kan indikera förändringar i totala mitophagy nivåer och kan inte skilja på stegen som blockering sker. Detta kan klargöras med hjälp av lysosomala hämmare (t.ex., E64d + Pepstatin A, kallas EP) parallellt kan orsaka ansamling av mitophagosomes. Skillnaden mellan antalet mitophagosomes vid baseline och antalet mitophagosomes efter behandling med EP kan indikera mitophagy. Dessa begränsningar har föranlett utvecklingen av Roman mitophagy detekteringsmetoder. Med tanke på den ökande betydelsen av mitophagy i ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar presenterar vi flera robusta mitophagy detektering tekniker som kan vara användbar för forskare. Vi täcker både in vitro- och in-vivo tekniker och rekommenderar att kombinera flera tekniker för att verifiera ändringar av mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Noggrann mätning av mitophagy är tekniskt krävande. Här har vi presenterat flera robust teknik som möjliggör för både kvalitativ detektion av mitophagy och kvantifiering av mitophagy nivåer i de vanligaste laboratorium experimentella modellerna.
Att förvärva replikerbara data, en experimentell design med minst tre biologiska upprepningar är nödvändigt. Alla forskare i experiment och analys måste vara blinda för experimentella gruppen identiteter. Dessutom skall imaging fält sl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Atsushi Miyawaki och Dr. Richard J. Youle för att dela mt-Keima plasmiden och mt-Keima integrerat Hela cells. Vi tackar Raghavendra A. Shamanna och Dr. Deborah L. Croteau för den kritiska behandlingen av manuskriptet. Denna forskning stöddes av intramurala forskningsprogrammet av NIH (VAB), bevilja National Institute on åldrande, samt en 2014-2015 och en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EFF, VAB). EFF stöddes av HELSE SOR-OST RHF (projekt nr: 2017056) och av Norges forskningsråd (projekt nr: 262175).
FÖRFATTARE BIDRAG:
EFF konstruerade manuskriptet och iordningställda utkastet. KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH och ED skrev olika avsnitt av papper; NT, JP, HN och VAB reviderade manuskriptet och förutsatt kompetens.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
