角膜组织工程: 人角膜间质神经相互作用的体外模型
Summary
本议定书描述了一个新的三维的体外模型, 其中角膜基质细胞和分化的神经细胞被培养在一起, 以协助检查和理解两种细胞的相互作用。
Abstract
组织工程学得到了大量的承认, 由于对人类角膜置换的高需求, 估计全世界有1000万人患有角膜视力损失1。为了满足对生存的人眼角膜的需求, 三维 (3D) 组织工程已取得重大进展2,3,4。这些角膜模型范围从简单单层系统到多层模型, 导致3D 全厚度角膜等效物2。
然而, 使用3D 组织工程角膜的环境中的体外疾病模型研究迄今缺乏相似的多层3D 角膜组织结构, 功能, 和网络的不同类型的细胞 (即, 神经,上皮, 基质, 和内皮)2,3。此外, 对体外角膜组织模型的需求也有所增加, 试图减少对药物产品的动物试验。因此, 更复杂的模型需要更好地匹配系统, 以人体生理需求, 和发展一个模型, 这是更相关的病人人口是绝对必要的。鉴于角膜中的多种细胞类型受疾病和营养的影响, 如圆锥、糖尿病角膜和福斯, 该模型包括一个由健康捐献者和神经元组成的人角膜成纤维细胞 (HCFs) 的3D 共培养模型。SH-SY5Y 细胞系。这让我们第一次研究人类角膜组织内两种细胞之间的相互作用。我们认为, 这种模式可能会解剖的基础机制与神经间相互作用的角膜疾病, 表现出神经损害。该3D 模型反映了角膜组织的基本解剖和生理特性在体内, 可以作为一种工具, 用于研究角膜缺损以及在动物试验前筛选各种药物的功效。
Introduction
在人体内, 角膜是最浓密的支配组织。神经是负责的各种感觉, 如触摸, 疼痛, 温度, 也有一个重要的作用, 伤口愈合, 眨眼反射, 撕裂生产, 并分泌5,6,7。在角膜中, 基质神经树干从角膜缘丛中产生, 并放射状地进入周围的角膜基质。基质神经组织是平行的胶原片, 他们进一步分支成更小的束簇, 因为他们走向表面基质5,8。神经纤维进一步穿透上皮层, 从而在角膜上皮和基质中广泛分布。因此, 神经支配在角膜的健康和患病状态中起着至关重要的作用。在这个协议中, 我们揭示了一个新的 3D体外模型的进展, 这是它的第一种模仿体内间质神经相互作用。这项研究使用了 SH-SY5Y 细胞系, 因为它是研究神经元生长的最成熟、最有特征的线之一。SH-SY5Y 细胞线已被描述产生两个基体附着物 (S 型) 和 neuroblastic (N 型) 细胞, 可以接受转分化9。因此, 即使这一细胞线是从三个连续的 N 型细胞克隆的选择, 它也包含了少量的 s-型细胞能够通过使用维甲酸和脑衍生的分化成神经元神经营养因子9。这提供了一个工具, 可能会导致更好地了解与糖尿病视网膜病变 (DM) 和其他眼部疾病相关的角膜并发症。由于与眼部疾病患者获得和培养神经元有关的困难, 这一3D 的体外模型在研究神经元相互作用和与角膜基质的信号传递方面具有重要的意义。
患病的情况往往会影响到身体的各种组织, 在很大的规模, 导致生活质量受损。眼部营养是常见的并发症, 往往与系统性疾病, 导致视力丧失, 甚至永久视力丧失。综合研究往往是必要的, 以更好地了解疾病的情况, 以及在基础细胞水平的影响。为了研究这些疾病的影响, 在组织工程应用的帮助下, 开发了各种体内和体外模型。角膜组织工程应用已在科学的各个领域获得了极大的兴趣10,11,12,13,14, 但仍然有主要的限制实际应用, 包括角膜移植排斥, 感染, 和疤痕10,11,12,13,14。有几项研究已经成功地开发和建立了各种体外模型3、15、16、17、18、 19,20,21,22,23,24,25,26。3D体外模型是最有希望和最具科学意义的。3D 模型可以更好地反映在纤维化和伤口愈合过程中至关重要的体内细胞和生理事件15、27、28、29。这些体外模型在寻找治疗不同疾病 (包括角膜并发症) 的新治疗方法方面起到了不可或缺的作用。尽管神经支配在角膜功能中起着至关重要的作用, 但在角膜组织工程结构中, 几乎没有为促进外周神经元增殖而做出努力2,3。然而, 建议的 3D体外细胞构造模拟目标组织, 以达到所需的组织功能。
虽然糖尿病角膜是一个明显的应用, 在这里所描述的模型, 由于神经元缺陷, 有几个其他的角膜疾病, 可以受益于人类的体外模型, 包括圆锥和福斯营养。我们的3D 模型从这一前景中产生, 并提出了一个体外的角膜组织的表征, 以评估新药的交付和新的眼科药物的安全性。
Protocol
Representative Results
Discussion
有几项研究的重点是开发各种动物模型, 可以帮助人们更好地了解角膜疾病以及发现治疗方法。然而, 这些研究对人类的重要价值还没有得到证实。到目前为止, 由于其显著的临床意义, 各种类型的体外模型已经得到了发展和广泛的研究。我们以前建立的 3D在体外模型是一个新的系统, 大大有助于医学科学进步的视觉研究和显示完美的能力, 综述在体内事件在体外<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们衷心感谢 Dr. 本. 福勒在 TEM 实验中的技术帮助。
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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