Une méthode générale pour la détection des Nitrosamide Formation du métabolisme In Vitro des Nitrosamines par Cytochrome P450s
Summary
Α-hydroxylation des nitrosamines cancérogènes par le cytochrome P450s est la voie métabolique acceptée qui produit des intermédiaires endommageant l’ADN, ce qui provoquent des mutations. Toutefois, les nouvelles données indiquent encore l’oxydation en nitrosamides peut se produire. Nous décrivons un général méthode pour détecter les nitrosamides produites in vitro du cytochrome P450-catalysée métabolisme de nitrosamines.
Abstract
N-nitrosamines sont un groupe bien établi des carcinogènes environnementaux, qui exigent l’oxydation du cytochrome P450 pour montrer l’activité. Le mécanisme accepté d’activation métabolique implique la formation de α-hydroxynitrosamines qui se décomposent spontanément aux agents alkylants ADN. L’accumulation de dommages à l’ADN et les mutations qui en résulte peut finalement mener au cancer. Nouveaux éléments de preuve indiquent que α-hydroxynitrosamines peut être encore oxydé nitrosamides progressivement par le cytochrome P450s. Parce que nitrosamides sont généralement plus stables que les α-hydroxynitrosamines et pouvez également alkylat ADN, nitrosamides peut jouer un rôle dans la cancérogenèse. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole général pour évaluer la production de nitrosamide de in vitro du cytochrome P450-catalysée du métabolisme des nitrosamines. Ce protocole utilise une approche générale de la synthèse de la nitrosamides pertinents et un essai in vitro du cytochrome P450 métabolisme avec par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide-tuyères d’ionisation-haute résolution pour la détection. Cette méthode détecté N′– nitrosonorcotinine comme un métabolite mineur de N′– nitrosonornicotine dans l’étude de l’exemple. La méthode a haute sensibilité et le dépistage de masse sélectivement due à précis. Application de cette méthode à une grande variété de systèmes de nitrosamine-cytochrome P450 aidera à déterminer la portée générale de cette transformation. Parce que le cytochrome P450s sont polymorphes et varier en activité, une meilleure compréhension de la formation de nitrosamide pourrait aider dans l’évaluation du risque individuel de cancer.
Introduction
N-nitrosamines sont une large classe de substances cancérigènes dans l’alimentation, de produits du tabac et de l’environnement en général ; ils peuvent également se former de manière endogène dans le corps humain1. Plus de 300 N –nitroso composés ont été testés et > 90 % ont été évalués comme cancérogène chez les modèles animaux2,3. Pour exposer leur cancérogénicité, ces composés doivent tout d’abord être activés par le cytochrome P450s1,2,3. La recherche montre que le cytochrome P450s oxyder facilement nitrosamines de α-hydroxynitrosamines (Figure 1), qui sont des composés très réactifs ayant une demi-vie de ~ 5 s avant de se décomposer spontanément à alkyldiazohydroxides. Ce dernier peut alkylat ADN après la perte de H2O et N2. Adduits de l’ADN qui en résulte, si non réparé, peut causer des mutations qui, en cas de critique onco – ou les gènes suppresseurs de tumeur, mener à cancer du développement1. Pour cette raison, beaucoup d’efforts ont été déployé afin d’acquérir une compréhension complète des voies métaboliques, adduits à l’ADN et des métabolites en aval de l’oxydation du cytochrome P450 des nitrosamines cancérigènes. Cette connaissance a application potentielle dans l’évaluation de risque de cancer individuel4.
Figure 1 : Général et métabolisme proposé des nitrosamines.
Nitrosamines (1) sont oxydés par P450s de α-hydroxynitrosamines (2) qui se décomposent spontanément à alkyldiazohydroxides (3). Ces composés peuvent lier à l’ADN pour former que des adduits d’ADN. On fait l’hypothèse que les 2 sont oxydés par P450s nitrosamides 4. Ceux-ci peuvent directement lier à l’ADN pour former de nouveaux ADN adduits ou être hydrolysé en 3 pour former que des adduits d’ADN connu. R1 et R2 représentent un groupe alkyle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Bien que l’hypothèse de le α-hydroxynitrosamine est solidement soutenue par nombreuses données, il y a quelques incohérences ; importante est la courte demi-vie des α-hydroxynitrosamines5,6. On sait que ces composés sont produits à la membrane du réticulum endoplasmique et plus tard alkylation de l’ADN nucléaire. Compte tenu de leur durée de vie de quelques secondes, c’est curieux comment ces intermédiaires survivent le voyage requis si le cytosol. Une hypothèse est qu’une partie de le α-hydroxynitrosamines s’oxydent progressivement nitrosamides7,8, qui sont assez stables en comparaison de9. Cela se produirait vraisemblablement par l’intermédiaire de rétention des α-hydroxynitrosamines dans le site actif de cytochrome P450. Précédent pour ce type d’oxydation a été constaté avec la nicotine10, alcools11et simple alkylnitrosamines12,13. En outre, nitrosamides sont action directe carcinogènes2,3. Basé sur leur réactivité9, ces composés sont crus pour produire de l’ADN des adduits identiques à celles qui résultent de le α-hydroxynitrosamines ainsi que de nouveau, adduits à l’ADN inexploré (Figure 1). Ainsi, cette hypothèse explique non seulement le transport à travers le cytosol, mais également la formation de l’ADN endommager les produits.
Dans cet article, on décrit un protocole général pour évaluer in vitro du cytochrome P450 induite par la conversion des nitrosamines nitrosamides. La conversion a déjà été indiquée de N′– nitrosonornicotine (NNN) N′– nitrosonorcotinine (NNC) de 2 a 6 du cytochrome P450 est présentée comme un exemple de14. Application du présent protocole à un large éventail de systèmes de substrat-enzyme aidera à déterminer l’importance des nitrosamides dans métabolisme global de nitrosamine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Élucider le métabolisme des nitrosamines est un élément essentiel à la compréhension de leur cancérogénicité. Étant donné que la cause du cytochrome P450s et autres enzymes métaboliques sont polymorphes, d’application de cette connaissance pourrait potentiellement identifier plus précisément haut risque particuliers1,4. Nouvelles données indiquent que l’oxydation supplémentaire des α-hydroxynitrosamines, les principaux métabolites présumée…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par grant pas. CA-81301 du National Cancer Institute. Nous remercions Bob Carlson pour aide à la rédaction, le Dr Peter Villalta et Xun Ming à l’aide de la spectrométrie de masse dans la ressource de partagée de biochimie analytique du Cancer Centre maçonnique et Dr Adam T. Zarth Dr Anna K. Michel pour leurs discussions précieuses et d’entrée. La ressource de partage de biochimie analytique est partiellement pris en charge par National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA-77598
Materials
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
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