Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van rhodamine 123 CLIC4 knockdown-geïnduceerde HN4 cel apoptosis in vitrostudie te identificeren van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP). Onder gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, werd de real-time verandering van de MMP opgenomen.
Abstract
Uitputting van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP, ΔΨm) wordt beschouwd als de vroegste gebeurtenis in de apoptotic cascade. Het komt zelfs voor nucleaire apoptotic kenmerken, met inbegrip van condensatie van de chromatine en DNA breuk. Zodra de MMP instortingen, cel apoptosis onherroepelijk begint zal. Een reeks van lipofiele kationische kleurstoffen kan de celmembraan passeren en statistische binnen de matrix van mitochondriën, en dienen als fluorescentie marker te evalueren van MMP verandering. Als één van de zes leden van de Cl– intracellulaire kanaal (CLIC) familie, deelneemt CLIC4 aan het proces van de apoptotic cel voornamelijk door middel van de mitochondriale pathway. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van MMP via het toezicht op de schommelingen van de fluorescentie van Rhodamine 123 (Rh123), via welke we apoptosis geïnduceerd door CLIC4 knockdown bestuderen. We bespreken de voordelen en beperkingen van de toepassing van confocale laser scanning en normale fluorescentie Microscoop in detail, en ook vergelijken met andere methoden.
Introduction
Rh123 is een fluorescentie kationogene kleurstof, die als indicator voor de transmembrane potentieel dient. Rh123 is in staat van doordringing van de celmembraan en het invoeren van de mitochondriale matrix afhankelijk van het potentiaalverschil van binnen en buiten de membraan-1. Apoptosis leidt tot schade van de mitochondriale membraan integriteit. De mitochondrion permeabiliteit overgang porie (MPTP) zal openen en leiden tot de ineenstorting van de MMP, die op zijn beurt tot de vrijlating van Rh123 aan de buitenkant van de mitochondriën leidt. Tot slot zal sterker groene fluorescentie signaal worden gedetecteerd onder fluorescentie Microscoop. Het is goed gedocumenteerd dat uitputting van de MMP en de verhoogde membraan permeabiliteit zijn vroege tekenen van cel apoptosis2. Daarom kunnen Rh123 worden toegepast op de opsporing van MMP verandering en het vóórkomen van cel apoptosis.
Als de 6 meest voorkomende carcinoom in de wereld verslechtert hoofd en nek kanker ernstig iemands gezondheid3. Hoewel vele benaderingen werden ontwikkeld in de afgelopen jaren, is klinische uitkomst van behandeling voor patiënten die lijden aan hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) nog steeds niet ideaal4. Verkennen van nieuwe therapeutische methoden kan het verbeteren van de behandeling voor HNSCC5. Ionenkanalen met tal van biologische processen weergegeven een belangrijke rol in de ontwikkeling van verschillende kankers6. Volledige of gedeeltelijke deelname van Cl– -kanalen zijn zeer betrokken bij de verschillende eigenschappen van neoplastische transformatie, inclusief de actieve migratie, hoge mate van verspreiding en invasiviteit. In dit licht is de CLIC, een roman eiwit familie, opgenomen als een veelbelovende klasse van therapeutische doelen voor6,7van de behandeling van de kanker. Recente studies is gebleken dat leden van de familie van de CLIC met inbegrip van CLIC1, CLIC4 en CLIC5, lokaliseren naar cardiale mitochondriale en het niveau van reactieve zuurstof soorten (ROS) is upregulated door CLIC5, met vermelding van de functionele rol van mitochondriale gelegen Cl – kanalen in de apoptotic reactie8. CLIC4, één van de leden van de familie van de CLIC (ook bekend als mtCLIC, P64H1 en RS43), heeft meest uitvoerig bestudeerd voor de apoptotic verordening eigenschappen in kankercellen en subcellular locatie inclusief endoplasmatisch reticulum, Golgi en mitochondrion in mens keratinocyten7,9,10. Het profiel van de expressie van CLIC4 werd geregeld door Tumornecrosefactor-α (TNF-α), P53 en externe prikkel. Overexpressie en Downregulatie van CLIC4 leiden tot een reactie van de apoptotic voornamelijk door middel van de mitochondriale traject begeleid met het gebrek aan evenwicht van Bcl-2 familie leden, activering van caspase cascade, en vrijlating van cytochroom C11, 12 , 13. Daarom MMP meting is cruciaal voor het verkennen van CLIC4-gerelateerde apoptosis en Rh123 dient als een ideale fluorescentie-indicator.
De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor de detectie van MMP te bestuderen CLIC4 knockdown-veroorzaakte apoptosis in HN4 cellen. Rh123 wordt gebruikt als een fluorescentie-sonde te observeren van de verandering van de MMP. Onder gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, kan de real-time schommelingen van de MMP worden opgelost. We bespreken de voordelen en beperkingen van de toepassing van confocale laser scanning fluorescentie Microscoop in detail, en ook vergelijken met andere methoden. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere apoptosis-gerelateerde studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is goed gedocumenteerd dat Cl− kanalen zijn van essentieel belang bij het handhaven van de hemostase van het interne milieu en spelen een belangrijke rol in de celproliferatie en apoptosis15,16. De relatie tussen ion kanaal-gerichte interventie en apoptosis daarom van grote behoefte en betekenis te vinden van een beter therapeutische aanpak voor verschillende kankers17. Mitochondriën handhaven de normale biologische toest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij vriendelijk dank de heer Chao Fang voor celkweek. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Natural Science Foundation van China (Grant nr. 81570403, 81371284); Anhui provinciale Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Outstanding Young Investigator van Anhui Medizinische Universität; Ondersteuning van programma voor uitstekende jonge talenten in de universiteiten van de oostelijke provincie Anhui.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
