זיהוי של המיטוכונדריה פוטנציאל ממברנה לימודים CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס במבחנה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט של יישום rhodamine 123 לזהות את מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (MMP) וללמוד CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס בתוך חוץ גופית. תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות לייזר קונפוקלי סריקה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, נרשם השינוי בזמן אמת של MMP.
Abstract
דלדול של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים (MMP, ΔΨm) נחשב האירוע המוקדם של המפל אפופטוטיים להיפגע. הוא אפילו מופיע לפני מאפייני הגרעין אפופטוטיים להיפגע, כולל כרומטין עיבוי ו- DNA שבירה. ברגע התמוטטויות MMP, תא אפופטוזיס תיזום בלתי הפיך. סדרת lipophilic cationic צבע יכול לעבור דרך קרום התא צבירה בתוך המטריקס של מיטוכונדריון ו לשמש סמן זריחה כדי להעריך את השינוי MMP. בתור אחד של שישה חברי Cl– משפחה ערוץ תאיים (לחץ על כד), CLIC4 משתתף תהליך מוות תא בעיקר דרך השביל מיטוכונדריאלי. כאן נתאר פרוטוקול מפורט כדי למדוד MMP באמצעות ניטור קרינה פלואורסצנטית התנודות של 123 Rhodamine (Rh123), שדרכו אנחנו לומדים אפופטוזיס שנגזרות CLIC4 נוקאאוט. לדון את היתרונות ואת המגבלות של היישום של סריקת לייזר קונפוקלי ושל קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ בפירוט, ואנו גם להשוות אותו עם שיטות אחרות.
Introduction
Rh123 הוא צבע cationic פלורסצנטיות, המגישה כמחוון עבור פוטנציאל transmembrane. Rh123 הוא מסוגל לחדור את קרום התא והזנת המטריקס מיטוכונדריאלי בהתאם מהפרש הפוטנציאלים של מבפנים ומבחוץ קרום1. אפופטוזיס מוביל לפגיעה של הקרומיות מיטוכונדריאלי. מיטוכונדריון חדירות מעבר הנקבובית (MPTP) לפתוח ולהוביל להתמוטט של MMP, אשר בתורו תוצאות במהדורה של Rh123 החיצוני של המיטוכונדריה. לבסוף, האות פלורסצנטיות הירוק החזק יזוהו במיקרוסקופ זריחה. זה מתועד היטב כי דלדול של MMP, חדירות הממברנה גבוהות הן סימנים מוקדמים של אפופטוזיס תא2. לכן, ניתן להחיל Rh123 הגילוי של שינוי MMP, המופע של התא אפופטוזיס.
כמו קרצינומה השישית הנפוץ ביותר בעולם, סרטן הראש והצוואר מתדרדר קשות בריאות של אדם3. למרות גישות רבות פותחו בשנים האחרונות, התוצאה הקלינית של הטיפול בחולים הסובלים הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) הוא עדיין לא אידיאלי4. חקר שיטות טיפוליות חדשות ניתן לשפר את הטיפול HNSCC5. תעלות יונים מעורבים תהליכים ביולוגיים רבים להציג תפקיד חשוב בהתפתחות של סוגי סרטן שונים6. השתתפות חלקית או מוחלטת של ערוצי Cl– מעורבים מאוד מאפיינים שונים של טרנספורמציה אמצעים כולל העברת פעיל, שיעור גבוה של התפשטות, invasiveness. לאור זאת, ולחץ כדי לירות, משפחה חלבון הרומן, רשומה כמחלקה המבטיחים של מטרות טיפוליות עבור סרטן טיפול6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו בני משפחת ולחץ כדי לירות, כולל CLIC1, CLIC4 CLIC5, בתרגום כדי הלב מיטוכונדריאלי, הרמה (ROS) מינים חמצן תגובתי upregulated מאת CLIC5, המציין את תפקיד פונקציונלי Cl מיטוכונדריאלי הממוקם – ערוצים אפופטוטיים להיפגע תגובה8. CLIC4, אחד מבני המשפחה ולחץ כדי לירות (הידוע גם בשם mtCLIC P64H1, RS43), נחקר באופן מקיף ביותר על תכונותיו תקנה מוות תאים סרטניים ובמיקום subcellular כולל גולג’י רשתית תוך-פלזמית, מיטוכונדריון-אנוש keratinocytes7,9,10. לפרופיל הביטוי של CLIC4 היה מוסדר על ידי גידול נקרוזה מקדם-α (TNF-α), P53, גירוי חיצוני. ביטוי ו downregulation של CLIC4 לעורר תגובה אפופטוטיים להיפגע בעיקר באמצעות מסלול מיטוכונדריאלי מלווה עם האיזון של בני משפחת Bcl-2, הפעלה של קספאז אשד ולאחר שחרורו של ציטוכרום C11, 12 , 13. לכן, מדידה MMP חיוני לחקור אפופטוזיס הקשורות CLIC4, ומשמש Rh123 כמחוון פלורסצנטיות אידיאלי.
המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט איתור MMP ללמוד CLIC4 נוקאאוט-induced אפופטוזיס בתאים HN4. Rh123 משמש כדי לבחון את השינוי של MMP בדיקה קרינה פלואורסצנטית. תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות לייזר קונפוקלי סריקה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, התנודות בזמן אמת של MMP ייתכן נפתרה. לדון את היתרונות ואת המגבלות של היישום של לייזר קונפוקלי פלורסצנטיות מיקרוסקופ בפירוט סורק, ואנו גם להשוות אותו עם שיטות אחרות. פרוטוקול זה גם יכול להחיל על מחקרים אחרים הקשורים אפופטוזיס.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה מתועד היטב כי Cl− ערוצים הם חיוני בשמירה על hemostasis של הסביבה הפנימית ולא לשחק תפקידים חשובים התפשטות תאים, אפופטוזיס15,16. לכן, הבנת הקשר בין התערבות ממוקדות ערוץ יון אפופטוזיס הוא של צורך גדול ואת המשמעות כדי למצוא גישה טיפולית כדאי עבור סוגי סרטן שונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נבקשך תודה מר צ’או פאנג תרבית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן מדעי הטבע של סין (מענק מס 81570403, 81371284); אנחווי מדעי הטבע מחוזי קרן (מענק מס 1408085MH158); החוקר צעירים מצטיינים של האוניברסיטה לרפואה אנחווי; התומכת בתוכנית כשרונות צעירים מעולה באוניברסיטאות של פרובינצית.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
