Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro
Summary
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l’applicazione della rodamina 123 per identificare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e studiare CLIC4 HN4 di atterramento-indotta delle cellule apoptosi in vitro. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la modifica in tempo reale di MMP è stata registrata.
Abstract
Lo svuotamento del potenziale di membrana mitocondriale (MMP, ΔΨm) è considerato l’evento più iniziale nella cascata apoptotica. Essa si verifica anche davanti le caratteristiche nucleari apoptotiche, tra cui la condensazione della cromatina e rottura del DNA. Una volta che i crolli MMP, apoptosi avvierà irreversibilmente. Una serie di coloranti cationici lipofilici può passare attraverso la membrana cellulare e di aggregazione all’interno della matrice del mitocondrio e servire da indicatore di fluorescenza per valutare il cambiamento MMP. Come uno dei sei membri di Cl– famiglia canale intracellulare (clicca), CLIC4 partecipa al processo di apoptosi cellulare principalmente attraverso la via mitocondriale. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare MMP, attraverso il monitoraggio della fluttuazione di fluorescenza di rodamina 123 (Rh123), attraverso il quale studiamo l’apoptosi indotta da atterramento di CLIC4. Discutiamo i vantaggi e i limiti dell’applicazione di scansione laser confocale e microscopio a fluorescenza normale in dettaglio e anche confrontarlo con altri metodi.
Introduction
Rh123 è un colorante cationico di fluorescenza, che serve come un indicatore per il potenziale transmembrana. Rh123 è in grado di penetrare la membrana cellulare e inserendo la matrice mitocondriale a seconda della differenza di potenziale di dentro e fuori la membrana1. Apoptosi porta a danni di integrità della membrana mitocondriale. Il poro di transizione di permeabilità (MPTP) di mitocondrio per aprire e condurre al collasso di MMP, che a sua volta provoca il rilascio di Rh123 verso l’esterno dei mitocondri. Infine, verrà rilevati più forte segnale di fluorescenza verde con microscopio a fluorescenza. È ben documentato che lo svuotamento delle MMP e permeabilità della membrana elevati sono i primi segni di apoptosi di cellule2. Di conseguenza, Rh123 può essere applicato per la rilevazione del cambiamento MMP e l’avvenimento di apoptosi delle cellule.
Come il 6a carcinoma più comune nel mondo, cancro del collo e della testa si deteriora gravemente salute3 una persona. Anche se molti approcci sono stati sviluppati negli ultimi anni, il risultato clinico del trattamento per i pazienti affetti da carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è ancora non ideale4. Esplorare nuovi metodi terapeutici può migliorare il trattamento per HNSCC5. Canali ionici che coinvolgono numerosi processi biologici visualizzano un ruolo importante nello sviluppo dei cancri differenti6. Partecipazione parziale o totale dei canali del Cl– sono altamente coinvolti in varie proprietà di trasformazione neoplastica tra cui migrazione attiva, alto tasso di proliferazione e l’invasività. Alla luce di ciò, il CLIC, una famiglia nuova proteina, è stato indicato come una promettente classe di bersagli terapeutici per il cancro trattamento6,7. Recenti studi hanno rivelato che membri della famiglia dei CLIC compresi CLIC1, CLIC4 e CLIC5, si localizzano cardiaco mitocondriale e livello di specie (ROS) reattive dell’ossigeno è aumentato da CLIC5, che indica il ruolo funzionale di mitocondriale trova Cl – canali nella risposta apoptotica8. CLIC4, membra della famiglia CLIC (noto anche come mtCLIC, P64H1 e RS43), è stato più ampiamente studiato per le sue proprietà di regolamento apoptotico nelle cellule tumorali e subcellulare posto tra cui Golgi, reticolo endoplasmatico e mitocondrio in umani cheratinociti7,9,10. Il profilo di espressione di CLIC4 era regolato dal fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), P53 e stimolo esterno. Sovraespressione e downregulation di CLIC4 innescare una risposta apoptotica principalmente attraverso la via mitocondriale accompagnata con lo squilibrio dei membri della famiglia Bcl-2, l’attivazione della cascata di caspase e rilascio di citocromo C11, 12 , 13. Pertanto, misura di MMP è cruciale per esplorare CLIC4-correlati apoptosis e Rh123 serve come un indicatore di fluorescenza ideale.
Lo studio presente descrive un protocollo dettagliato per la rilevazione di MMP per studiare CLIC4 indotta da atterramento di apoptosi in cellule di HN4. Rh123 viene utilizzato come una sonda a fluorescenza per osservare il cambiamento di MMP. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la fluttuazione in tempo reale di MMP può essere risolta. Discutiamo i vantaggi e le limitazioni dell’applicazione del laser confocale, microscopio a fluorescenza in dettaglio e anche confrontarlo con altri metodi. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri studi di apoptosis-relativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
È ben documentato che Cl− canali sono essenziali per mantenere l’emostasi dell’ambiente interno e giocano un ruolo importante nella proliferazione cellulare e apoptosi15,16. Quindi, comprendere la relazione tra intervento di targeting canale ionico e apoptosi è di grande necessità e importanza di trovare un migliore approccio terapeutico per vari cancri17. Mitocondri mantengono il normale stato biologico di una cella e la s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Mr. Chao Fang per colture cellulari. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione Scienza naturale della Cina (Grant n. 81570403, 81371284); Anhui Provincial Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Eccezionale giovane ricercatore dell’Università medica di Anhui; Programma di sostegno per talenti eccellenti giovani nelle Università della provincia di Anhui.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
