CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

요약

여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

초록

(MMP, ΔΨm) 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 고갈 apoptotic 캐스케이드에 초기 이벤트로 간주 됩니다. 그것은 심지어 핵 apoptotic 특성, chromatin 응축 및 DNA 파손 등 앞서 발생 합니다. 일단 MMP 붕괴, 세포 apoptosis 돌이킬 시작 됩니다. 질 성 양이온 염료의 일련 수 있습니다 세포 막 통과 mitochondrion, 매트릭스 내부 집계 및 MMP 변화를 평가 하기 위해 형광 마커 역할. Cl^- 세포내 채널 (클릭) 가족의 6 멤버 중 하나로 CLIC4 주로 미토 콘 드리 아 통로 통해 셀 apoptotic 과정에 참여합니다. 여기 우리가 Rhodamine 123 (Rh123),이 통해 우리가 공부 CLIC4 최저에 의해 유도 된 apoptosis의 형광 변동 모니터링 통해 MMP를 측정 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 및 세부 사항에, 일반 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여.

서론

Rh123 막 횡단 잠재력을 위한 지시자로 봉사 하는 양이온 형광 염료 이다. Rh123은 세포 막을 관통 하 고 막¹내외의 잠재적인 차이 따라 미토 콘 드리 아 매트릭스 입력 가능 합니다. Apoptosis는 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성의 손상으로 이어집니다. Mitochondrion 침투성 전환 기 공 (MPTP) 열고에 미토 콘 드리 아의 바깥쪽에 Rh123의 방출 귀착되는 MMP의 축소로 이어질 것 이다. 마지막으로, 형광 현미경 강한 녹색 형광 신호를 감지 됩니다. 그것은 잘 MMP와 높은 막 침투성의 고갈 세포 apoptosis²의 초기 징후는 문서화 되어있다. 따라서, Rh123는 MMP 변화의 검출 및 세포 apoptosis의 발생에 적용할 수 있습니다.

세계에서 여섯번째 가장 일반적인 암으로 머리와 목 암 심각 하 게 사람의 건강³악화. 있지만 많은 접근은 최근 몇 년 동안에 개발 되었다, 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에서 고통 받는 환자에 대 한 치료의 임상 결과 여전히 이상⁴. 새로운 치료 방법을 탐구 하는 것은 HNSCC

프로토콜

1. 세포 배양과 Transfection

1. 세포 배양
   참고: HN4, HNSCC 셀 라인, HNSCC¹⁴를 가진 환자에서 파생 되었다.
   1. Dulbecco의 문화 HN4 셀이 글 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 (100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스) 보완 수정. 셀 5% CO₂와 37 ° C에서 품 어.
2. 세포 transfection
   1. Transfection, 전에 1 일 플레이트 5 x 10⁵ 셀 2 mL/6 잘 플레이트에 항생제 없이 문화 매체의.
   2. 부드럽게 100 pmol CLIC4 siRNA 또는 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 스크램블 된 SiRNA를 희석. 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 5 µ L liposome 시 약을 희석 하 고 5 분 결합 희석된 liposome 시 약으로 희석된 siRNA에 품 어, 부드럽게, 혼합 실 온에서 20 분 동안 품 어.
   3. 각 잘 셀 및 매체를 포함 하는 혼합물을 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤 판 락....

결과

현재 연구에서 Rh123는 MMP 감지에 적용 되었습니다. 처음, HN4 셀 다음 형광 실험을 얼룩에 대 한 교양 했다. 핀셋 6 잘 플레이트(그림 1)의 하단에 원형 coverslips를 넣어 사용 했다. 5 분에 대 한 polylysine는 coverslips 코팅 했다 고는 polylysine pipettor (그림 1B)를 통해 제거 하는 다음. 다음 HN4 셀 trypsinized 되었고 6 잘 플레이트의 하단에 배치 하는 coverslips에 시드. 다음, Rh123의 적절 한 금액은 추가 하 고 혼합 잘 (그림 1C-D). 데워 NPSS 세척, 후는 coverslip 보기 챔버로 조립 되었다. 적절 한 양의 N.......

토론

잘 Cl⁻ 채널 hemostasis 내부 환경의 유지에 필수적 이며 세포 증식 및 apoptosis^15,16에 중요 한 역할을 문서화 되어있다. 따라서, 다양 한 암¹⁷에 대 한 더 나은 치료 방법의 찾을 큰 필요와 중요성의은 이온 채널 대상 개입 및 apoptosis의 관계를 이해. 미토 콘 드리 아 세포의 정상적인 생물학적 상태를 유지 하 고 기능 높은 막 침투성 및 막 횡단 잠재력에 관한. 암, 떨어져 축적 neuropathological 조사 문서화 미토 콘 드리 아 이상 myopathy, 심혈 관 질환, 감각 청각, 소 뇌 운동 실 조, 치 매 등 신경 증상에 기여 그리고 간 질^18,19. 이러한 모든 임상 치료를 개량 하는 개입 대상으로 미토 콘 드.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HNSCC 세포	ATCC	CRL-3241
폴리리신	Thermo Fisher Scientific	P4981
Biomics	를	위한 특이적 siRNA	(등록 번호, NM_013943; cDNA 서열에 해당 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) 및 스크램블 siRNA(5 ACGCGUAACGCGGGAAUUUU-3)는 Biomics Company
에서 설계 및 획득하였습니다.Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I 환원 혈청 배지, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure grede	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco' 변형 이글 배지 (DMEM, 4.5 g/L 포도당)	Gibco	11965-084
소 태아 혈청, 적격, 호주 원산지	Gibco	10099141
트립신-EDTA 용액	Beyotime	C0201
항생제-항진균제, 100X	Gibco	15240062
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica Microsystems GmbH	LEICA. SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 도립 현미경	Nikon	N/A
Metaflour, v7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	해당 없음
Leica 응용 프로그램 제품군, v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	해당 사항 없음
Microsoft Office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat 소프트웨어	N/A
아토플루오르 세포 챔버	Thermo Fisher Scientific	A7816

human CLIC4 NM_013943