Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti
Summary
Burada mitokondri zar potansiyel (MMP) belirlemek ve CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre apoptosis içinde vitroçalışma rodamine 123 uygulanması için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı değişiklik kaydedildi.
Abstract
(MMP, ΔΨm) mitokondri zar potansiyel tükenmesi apoptotik art arda en erken olay olarak kabul edilir. Hatta kromatin yoğunlaşma ve DNA kırılması gibi nükleer apoptotik özellikleri öncesinde ortaya çıkar. Bir kez MMP çöker, hücre apoptosis geri dönüşümsüz başlatacaktır. Lipofilik katyonik boya bir dizi hücre membran geçmek ve mitokondri matriksi içinde toplamak ve MMP değişiklik değerlendirmek için floresans marker olarak hizmet. Cl– hücre içi kanal (klik) Aile, altı üyelerinden biri hücre apoptotik süreci mitokondrial yolu üzerinden olmak üzere CLIC4 katılmaktadır. Burada rodamine 123 (Rh123), hangi aracılığıyla biz apoptosis CLIC4 nakavt tarafından indüklenen çalışma floresans dalgalanma izleme yoluyla MMP ölçmek için detaylı bir protokol açıklayın. Biz tartışın avantajları ve confocal lazer tarama ve normal floresan mikroskop ayrıntılı uygulama sınırlamaları ve ayrıca diğer yöntemleri ile karşılaştırın.
Introduction
Rh123 transmembran potansiyel bir göstergesi olarak hizmet veren bir katyonik floresans boya var. Rh123 hücre zarı delici ve mitokondrial matris bağlı olarak potansiyel farkı iç ve dış membran1girme yeteneğine sahiptir. Apoptozis mitokondrial membran bütünlüğü zarar yol açar. Mitokondri geçirgenliği geçiş gözenek (MPTP) açın ve sırayla mitokondri dışına Rh123 sürümdeki sonuçları MMP, daraltmak için yol. Son olarak, güçlü yeşil floresans sinyali floresan mikroskop altında tespit edilecektir. MMP ve yükseltilmiş membran geçirgenliği tükenmesi hücre apoptosis2erken ibretler vardır iyi belgelenmiştir. Bu nedenle, Rh123 MMP değişiklik algılanması ve hücre apoptosis oluşumu için uygulanabilir.
Dünyada 6 en yaygın Karsinomu, baş ve boyun kanser ciddi bir kişinin sağlık3bozulur. Her ne kadar pek çok yaklaşım son yıllarda geliştirilen, hastalarda baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) için tedavi klinik sonuçlar hala ideal değil4‘ tür. Yeni tedavi yöntemleri keşfetmek tedavisi için HNSCC5artırabilirsiniz. İyon kanalları çok sayıda biyolojik süreçlerin içeren farklı kanser6gelişiminde önemli bir rol görüntüler. Kısmi veya toplam katılım Cl– kanalları son derece neoplastik dönüştürme etkin geçiş, yüksek orandaki yayılması ve invasiveness dahil olmak üzere çeşitli özelliklerini ilgili vardır. Bunun ışığında, CLIC, roman protein ailesi, kanser tedavi6,7için tedavi hedefleri gelecek vaat eden bir sınıf olarak listelendi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya CLIC1, CLIC4 ve CLIC5, gibi CLIC ailesinin üyeleri kalp mitokondrial yerelleştirmeniz ve reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesini mitokondrial bulunan Cl işlevsel rolü gösteren upregulated tarafından CLIC5, – kanalları apoptotik yanıt8. CLIC4, bir ailenin üyesi, CLIC (olarak da bilinen mtCLIC, P64H1 ve RS43) en yaygın kanser hücreleri ve hücre altı yerini Golgi, endoplazmik retikulum ve mitokondri içinde insan gibi onun apoptotik düzenleme özellikleri çalışılmıştır keratinositler7,9,10. CLIC4 ifade profil tümör nekrozis faktör-α (TNF-α), P53 ve dış uyarıcı tarafından düzenlenmiş. Overexpression ve CLIC4 downregülasyon esas olarak dengesizlik Bcl-2 aile üyeleri ile caspase art arda sıralı aktivasyonu ve serbest bırakmak-in sitokrom C11, eşliğinde mitokondrial yolu aracılığıyla bir apoptotik yanıt tetikler 12 , 13. bu nedenle, MMP ölçümdür apoptosis CLIC4 ilgili keşfetmek çok önemli ve Rh123 bir ideal floresans göstergesi olarak hizmet vermektedir.
Bu da çalışmanın CLIC4 nakavt kaynaklı apoptosis HN4 hücrelerdeki çalışmaya MMP tespiti için ayrıntılı bir protokolünü açıklar. Rh123 bir floresan sonda MMP değişimi gözlemlemek için kullanılır. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı dalgalanma çözülmüş olabilir. Biz tartışın avantajları ve confocal lazer floresan mikroskop ayrıntılı tarama uygulanması sınırlamaları ve ayrıca diğer yöntemleri ile karşılaştırın. Bu iletişim kuralı da apoptozis ile ilgili diğer çalışmalar için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cl− kanalları iç ortam hemostaz sürdürmek için gerekli olan ve hücre proliferasyonu ve Apoptozis15,16önemli rollerde oynamak iyi belgelenmiş. Bu nedenle, iyon kanal hedefli müdahale ve Apoptozis ilişkisi büyük ihtiyaç ve önemi bir daha iyi tedavi yaklaşımı çeşitli kanserlerin17için bulmak için en önemli noktadır. Mitokondri bir hücre normal biyolojik durumunu korumak ve onun fonksiyonu son derece onun m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lütfen Bay Chao Fang hücre kültürü için teşekkür ederiz. Bu eser hibe Çin doğal Bilim Vakfı (Grant No 81570403, 81371284); tarafından desteklenen Anhui il doğal Bilim Vakfı (Grant No. 1408085MH158); Anhui Tıp Üniversitesi üstün genç araştırmacı; Program Anhui eyaleti üniversitelerde mükemmel genç yetenekleri için destek.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
