Oppdagede nylig oksidert former for 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) kan representere distinkte DNA endringer med unike funksjonsroller. Her beskrives en semi kvantitative arbeidsflyt for visualisering av oxi-mCs’ romlige fordelingen, signalet intensitet profilering og colocalization.
I flere tiår, har 5-methylcytosine (5mC) vært antatt å være den eneste DNA modifiseringen med en funksjonell betydning i Metazoer. Oppdagelsen av enzymatisk oksidasjon av 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) samt gjenkjenning av N6-methyladenine (6mA) i DNA av multicellular organismer gitt flere grader av kompleksitet til epigenetic forskning. Ifølge en økende mengde eksperimentelle bevis, kan endringene for romanen DNA spille spesifikke roller i ulike mobilnettet og utviklingsmessige prosesser. Viktigere, som noen av disse merkene (e. g. 5hmC, 5fC og 5caC) utstilling vev- og utviklingsmessige scenen-spesifikk forekomst i virveldyr, representerer immunochemistry et viktig verktøy slik at vurdering av romlige fordelingen av DNA endringer i ulike biologiske sammenhenger. Her er metodene for beregningsorientert analyse av DNA modifikasjoner visualisert ved immunostaining etterfulgt av AC confocal mikroskopi beskrevet. Spesielt generasjonen av 2,5 dimensjon (2.5 D) signal intensitet tomter, signal intensitet profiler, kvantifisering av flekker intensitet i flere celler og fastsetting av signal colocalization koeffisienter vises. Samlet kan disse teknikkene være i vurdere nivåene og lokalisering av endringene DNA i kjernen, bidra til Klargjørende deres biologiske roller i Metazoer.
DNA metylering, en godt dokumentert mekanisme knyttet transcriptional regulering innebærer endring av cytosine rester i en 5-cytosine-fosfat-guanine-3 “(CpG) dinucleotide sammenheng via tillegg av en metylgruppe (-CH3) til den 5 – karbonatom cytosine pyrimidine ringen til 5-methylcytosine (5mC)1. I pattedyr, er ca 70% av forbruksvarer denaturert som utgjør bare 1% av deres genomer som de blir utarmet av denne palindromic på grunn av 5mC mutagene tilbøyelighet til å spontant deaminate thymine2. Tilstedeværelsen av methyl grupper på arrangøren gensekvenser viser sterk sammenheng med transcriptional undertrykkelse i virveldyr3,4,5. Tillegg av gruppene metyl er katalysert av høyt konservert DNA methyltransferase (DNMT) enzymer DNMT3a 3b og 3 L og DNMT1 som endre CpG cytosines i de novo og vedlikehold metylering sammenhenger henholdsvis6. DNMT3A/B uttrykk er opphøyet under utvikling i embryonale stamceller og epiblast; men redusert uttrykket er observert etter pluripotent celle avstamning forpliktelse til somatiske skjebne under differensiering8. Mens deler funksjonelle redundans, viser DNMT3a og 3b vev-spesifikke uttrykk mønstre, med 3a oppdaget jevnt i mouse embryoer men 3b hovedsakelig lokalisert til neuroectoderm og Chorion ektoderm vev8.
Metylering signaturer kan arves under mitose og meiose10. Vedlikehold metylering innebærer DNMT1 tilrettelagt endring av CpG cytosine rester finnes i hemi-denaturert palindromes på double-strandet DNA11. DNMT1 binder DNA ved replikering gafler11 og derfor genomisk metylering nivåer topp i S fasen av cellen syklus12. DNMT1 Sam-e methoxide uforandret cytosines dermed skille nylig syntetisert DNA tilnærmingene, fremme X-chromosome inaktivering og opprettholde transcriptional undertrykkelse profiler13. Gjennom anerkjennelse av hemi-denaturert DNA CpG sekvenser opprettholder DNMT1 etablerte bruksmønstre metylering grenser til de novo metylering f.eks undertrykkelse av lang ispedd kjernefysiske Element 1 (linje1) retrotransposon arrangører å hemme den potensielt kreftfremkallende forplantning14. Men besitter hemi-denaturert DNA fortrinnsrett forpliktende tilhørighet, kan DNMT1 methylate unmethylated CpG øya (CGI) sekvenser i DNMT3a/b – / – mutant celler, oppfylle en nødsituasjon de novo metylering rolle15 . Dermed på grunn av DNA replikering16semi-konservativt natur, kan vedlikehold metylering trofast recapitulate metylering signaturer fra overordnet datter celle17.
Men for genet må uttrykk være dynamisk modulert, undertrykkende metylering endring slettes, som kan oppnås ved passive og aktive demethylation mekanismer18. Ti-elleve Translocase (TET) proteiner tilhører en bevart familie dioxygenase proteiner er dugelig av iterativ oksidasjon av methyl grupper på CpG rester19. Disse Tet proteiner, homologe J-Base bindende proteiner (JBP) oppdaget i Trypanosome bruceii, gjenkjenner og binder endret DNA baserer f.eks 5mC og oxygenate disse rester 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) og 5 – carboxylcytosine (5caC)20. Tet protein tilrettelagt oksidasjon av 5mC resulterer i gradvis konformasjon endring fra metyl hydroksyl, karbonyl og carboxylate konfigurasjoner, men 5fC og 5caC modifikasjoner kan syntetiseres direkte fra 5mC oksidasjon21, 22 , 23 , 24.
En informativ indikasjon TET protein aktivitet forstå deres regulering studerer distribusjon og overflod av oxi-metyl-cytosine merker. Betydelig 5mC tilstedeværelse på CpG dårlig arrangører er synlig i motsetning til unmethylated CpG rike regioner, den sistnevnte er karakteristisk for CpG øyene25. Over vev, høyeste vev bestemt metylering er observert i hjernen, testikkel og blod mens oral mucosa utstillingen største hypomethylation, angir du en differensiell metylering mønster på vev bestemte arrangørene26.
Gjennom følsom anti-5mC og anti-5hmC viste antistoffer i selektiv metyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) og påfølgende høy gjennomstrømning sekvensering, Ficz et al. høy 5hmC belegg på arrangører, exons og LINE-1 retrotransposon sekvenser som korrelert med redusert 5mC nivåer på disse stedene i mus embryonale stilk celler27. Omvendt, ble største 5mC berikelse observert på repeterende satellitt sekvenser hvor 5hmC tilstedeværelse var begrenset28. Studier utført på menneskelig frontallappen hjernevev avslører svært betydelig 5hmC berikelse, fire ganger høyere enn i mus embryonale stamceller28. I samsvar med tidligere observasjoner, høy gjennomstrømning sekvensering av frontallappen vev illustrert fleste 55-59% av 5hmC signal lokalisert på lav tetthet CpG promoter regioner, 35-38% innen genet organer og ca 6% bruk på intergenisk regioner. I kontrast, 5mC anriket intergenisk regioner (25-26%) og høyere innen genet organer (52-55%) men redusert (22-24%) på arrangøren sekvenser29. Disse studiene viser overflod av 5hmC i embryonale stamceller og somatiske vev, spesielt hjernen, men undersøkelser på 5fC og 5caC distribusjoner er begrenset.
Interessant, nylig oppdaget i eukaryoter, metylering av adenine rester på posisjon 6 nitrogen (N6) (6mA) vise en genomisk overflod profil inverse som 5mC30. Observasjoner fra flytende kromatografi kombinert tandem massespektrometri avsløre 6mA absolutte nivåer i overskudd i zebra fisk og svin tidlig embryo sammenlignet med sperm med sin nivåer (0.003% av genomic adenines) øker stadig på befruktning, topp på morulastadiet utviklingsstadiet (33 ganger høyere enn sperm) og nå steady state somatiske nivåer av 0.004% av genomic adenines31. Immunoprecipitation av 6mA beriket DNA-sekvenser har vist dominerende belegg (ca 80% berikelse) med dette merket på repeterende element regioner og transcriptional start nettsteder32. Disse observasjonene kontekstualisere og validere oppdagelsen av 6mA demethylase-null embryonic stamceller viser akkumulert 6mA mediert linje-1 retrotransposon stanse sammenlignet med transcriptionally aktive elementer i wildtype celler. Disse data tyder på en transcriptional regulatoriske funksjon for 6mA33.
Mens konjugert biokjemiske tags koblet til etterfølgende DUKKERT analyser indikerer tilstedeværelse eller fravær av oksidert methylcytosine derivater (oxi-mCs), kan ikke de gi romlige fordelingen eller kvantifiserbare informasjon på disse merkene34, 35. en protokoll for sensitive talipes påvisning av 5hmC og 5caC ble nylig utviklet36. Denne fluorophore konjugert sekundære antistoff-baserte immunostai-metoden kombinert med utnytte skanning laser AC confocal mikroskopi har den unike fordelen av å gi visuelle lokalisering av endringene DNA i cellene, dermed understreker personlige farget positivt eller negativt celler tilsvarende med heterogene tilstedeværelsen av disse merkene. 5hmC og 5caC absolutt signal intensiteten aktiverer som forsterkes av konjugert antistoffer semi kvantitative tolkninger vil bli foreslått om størrelsen og plasseringen av merkene i kjernen f.eks heterochromatic og euchromatic 37 , 38. her en teknikk for beregningsorientert analyse av AC confocal mikroskopi bilder er beskrevet. Generering av 2.5D romlige fordelingen tomter for å vise forskjellige 5hmC og 5caC signal topper per piksel og deres steder i kjerner er vist. Histogrammet tomter av 5hmC og 5caC signal intensitet profiler kan illustrere trender i overflod av merkene som topper og trau plottes som separate ikke-overlappende kanaler. Endelig ved å implementere funksjonen colocalization, graden av nærhet til et signal til en annen kan bestemmes og dermed sine respektive genomisk koordinater kan identifiseres.
Denne protokollen beskriver trinnvis prosessen med å generere visuelle representasjoner av DNA endringer i kjerner. Mens følsom og virkningsfulle, disse teknikkene har flere begrensninger.
Det er nødvendig å understreke at dataene som genereres fra 2.5D tomter, signalet intensitet profiler og colocalization analyse er halvt kvantitative i naturen. På grunn av punkt til punkt belysning av prøven under bildeopptak på laserskanning AC confocal mikroskop, registreres absolutt signal intensiteter av hver kanal. Men dette er ikke absolutt magnitudes av 5hmC og 5caC blir oppdaget og bare representerer indikasjoner på tilstedeværelse, fravær eller omfanget av merkene epigenetic.
På grunn av repetitive natur signal amplifications forvirre begrensninger samsvarer med omfanget av maskiner brukt for å styrke signalet uunngåelig tilnærmelser av ekte fysiske genomisk innholdet av disse merkene34. Den sanne genomic lokaliseringen av merkene kan være skjult av disse store proteiner, som fysisk opptar områder uløselig selv ved optimal AC confocal oppløsning grenser på 200-300 nm34. Videre kan ikke signal intensiteter av enkeltkanalene for hvert merke sammenlignes med hverandre skyldes forskjeller i antistoff følsomhet og fluorophore Bøyning34. Men kaster innhentet informasjon med imaging lys over romlige og tidsmessige organiseringen av genomisk merkene.
For nøyaktig kvantifisering av 5hmC og 5caC signaler, er kjerner uthevet og omkranset mot DAPI counterstain, klart demarcating regionen som skal analyseres. Denne prosedyren dispenses med behovet for å kalibrere gating terskler som bakgrunnsstøy ignoreres gjennom den manuelle prosessen med å velge kjerner1. En automatisering av prosessen kan oppnås i den nyeste programvaren som tillater kjernefysiske segmentering skal utføres. Mens gratis alternativ programvare pakker som FIJI er tilgjengelig for colocalization analyse, ulemper som kravet om å konvertere bilder til binære 8 bit formater, maskering bilder og innrykker størrelse utelukkelse dataene for å velge områder av interesse grense det bruker-tilgjengelighet av dette programmet. I tillegg introduserer vurderer totalt begrenset 5hmC og 5caC i genomet kombinert med sine dominerende beliggenhet ved euchromatic regioner og uttømming av genomisk CpG sekvenser generelt, manuell omringe av kjerner bruker-bias. Derfor uthevingen av kjerner automatisk antar alle hendelser i avgrensede regionen å være positive og ignorerer alle pikslene som kan være til stede. Dermed kan analysere bilder basert på pixel intensitet være mer meningsfylt. Disse faktorene er viktig når det gjelder bruk av Mander’s colocalization koeffisienten analysere graden av romlige overlapping mellom to signaler, uavhengig av deres signal intensiteter som motsetter til Pearsons korrelasjonskoeffisient som forutsetter en lineær relasjon mellom signaler.
Samlet bære teknikker skissert her temaet for visuell representasjon av biologiske data på en intuitiv format. Mens semi kvantitative bildeanalyser ikke erstatter kraftig teknikker som massespektrometri i følsomhet eller én base oppløsning genomet bredt sekvensering, det gir utfyllende data slik at slutninger og hypoteser skal unnfanget fra analyse av bilder med presisjon.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council [BB/N005759/1 til A.R.]. NRFH ble finansiert av The Rosetrees Trust og The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskopet, behandling datamaskiner og programvare ble finansiert av BBSRC BB/L013827/1 (tverrfaglig Super-oppløsning mikroskopi anlegg på Nottingham University grant)
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
Microsoft Excel | Microsoft | NA |