Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación
Summary
Se describe un método fácil, rápido y relativamente barato para la generación de gene-disrupted Streptococcus mutans cepas; Esta técnica puede ser adaptada para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.
Abstract
Métodos típicos para la aclaración de la función de un gen en particular implican Analisis comparativo fenotípicas de la cepa de tipo salvaje y una cepa en la que el gen de interés se ha visto alterado. Una construcción de DNA gen-interrupción que contiene un gen marcador de resistencia antibiótica adecuada es útil para la generación de cepas alterado por la gen en la bacteria. Sin embargo, métodos de construcción convencionales, que requieren medidas clonaje de genes, implican protocolos complejo y desperdiciador de tiempo. Aquí, se describe un método relativamente fácil, rápido y rentable para la interrupción de genes específicos en Streptococcus mutans . El método utiliza una fusión de paso 2 reacción en cadena polimerasa (PCR) para generar el concepto de interrupción y electroporación para transformación genética. Este método no requiere de una reacción enzimática, que no sea de la polimerización en cadena y además ofrece una mayor flexibilidad en cuanto al diseño de la construcción de la interrupción. Empleo de la electroporación facilita la preparación de células competentes y mejora la eficiencia de transformación. El presente método puede adaptarse para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.
Introduction
Análisis de la función génica implica típicamente una comparación fenotípica entre una cepa de tipo salvaje y una cepa en la que un determinado gen de interés se ha visto alterado. Esta técnica de interrupción génica se ha utilizado para el análisis de la función del gene en una amplia gama de especies, desde bacterias hasta mamíferos. Un constructo gene-interrupción es necesario para la generación de la cepa gen interrumpido; Esta construcción de ácido desoxirribonucleico (ADN) consiste en el gen marcador de resistencia a los antibióticos sobre el upstream y downstream flanqueando las regiones del gen blanco y se incorpora en el genoma por recombinación homóloga. La cepa gen interrumpido puede ser aislada usando medios selectivos que contienen el antibiótico. El método convencional utilizado para la construcción de la cepa gen interrumpido requiere medidas complejas, como la amplificación del gen por reacción en cadena de polimerasa (PCR), la ligadura del gen en un plásmido adecuado, digestión con restricción de destino enzimas y religación para insertar el gen marcador de resistencia a antibióticos. Este proceso es lento, tomando varios días a varias semanas, dependiendo el éxito de cada paso. Además, el diseño de construcciones de la interrupción depende de los sitios de la enzima de la restricción del gene blanco. Para resolver estos problemas, se han reportado DNA Polimerización en cadena-basado que empalma métodos1,2 para el diseño de mutantes gene-disrupted de Dictyostelium discoideum3 y Synechocystis SP. PCC68034 . En el presente estudio, se desarrolló un método para generar una cepa estreptocócica gen interrumpido de una manera relativamente rápida, fácil y de bajo costo, utilizando un método modificado basado en PCR (señalado paso 2 fusión PCR) para la construcción de la interrupción construcción y electroporación para transformación genética.
La fusión de 2-step que PCR requiere de ADN genómico, el gen marcador de resistencia a los antibióticos como una plantilla PCR y cuatro pares de apropiadamente diseñado cartillas del oligonucleótido. En el primer paso (1st de PCR), una región que flanqueaba aguas arriba de 1 kb del gene del destino, una región que flanqueaba aguas abajo de 1 kb del objetivo gen y el gen marcador de resistencia a antibióticos se amplifican por PCR. Las regiones 5′ de la cartilla reversa y la cartilla hacia adelante, para la amplificación de la aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones, respectivamente, incluyen 15 bases complementarios a los extremos del gen marcador. Las 5′ regiones de avance y retroceso primers para la amplificación del gen marcador igualmente incluyen 15 bases complementarias a la parte inferior de la región que flanqueaba por aguas arriba de la gene de la blanco y el extremo superior de la región que flanqueaba corriente abajo del gen blanco, respectivamente. Por lo tanto, los tres fragmentos amplificados contienen regiones de 30-pares superpuestos en el sitio de fusión. En el segundo paso (2nd PCR), PCR se realiza con las cartillas PCR anidadas utilizando los tres fragmentos amplificados por la 1st PCR como plantillas. Las regiones complementarias de las plantillas están además vinculadas entre sí a través de la 2nd PCR. Por último, la construcción para la recombinación homóloga es introducida a la cepa de tipo salvaje por electroporación. Interrupción génica exitosa puede ser verificada por PCR usando las cartillas específicas. Aunque el concepto de interrupción se amplifica utilizando la DNA polimerasa de alta fidelidad, reacciones enzimáticas adicionales, tales como la ligadura de la DNA o digestión de DNA, no son necesarias para generar la construcción. Además, una región eliminada o conservada en el genoma puede ser elegida fexiblemente según primer diseño.
En el presente trabajo, canceladura de la región entera de la codificación del gene gtfC , que codifica la glucosiltransferasa de Streptococcus mutans, se realizó para demostrar el método de interrupción del gene rápido, fácil en una especie estreptocócica. Además, un gtfB-alteración de la tensión se generó de la misma manera. Glucosiltransferasas codificados por gtfB y gtfC contribuyen a cariogénicas biofilm dental desarrollo5,6. Las capacidades de formación de biofilm del tipo tensión (S. mutans WT), gtfC-interrumpió cepa (S. mutans ΔgtfC) y gtfB-tensión interrumpida (S. mutans ΔgtfB) se evaluaron análisis fenotípico comparativo. Este protocolo extiende la aplicación de un método de dos etapas para la interrupción del gene de una especie adicional y puede ser modificado para los estudios de función del gen en una amplia gama de taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente Protocolo, deberán diseñarse los iniciadores 1st PCR para amplificar 1 kb aproximadamente aguas arriba y aguas abajo flanqueando las regiones de la región de destino en el genoma. Tales secuencias largas que flanquean son necesarios para mejorar la eficacia de la recombinación homóloga.
Las secuencias de los cebadores (arriba-atrás, abajo-adelante, spcr-adelante y spcr-reversa) en el presente Protocolo se determina automá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia [números de concesión 16 K 15860 T.M. y 15 K 15777 N.H.].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
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