Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Summary

Descriviamo un metodo facile, rapido e relativamente poco costoso per la generazione di gene-interrotto lo streptococco mutans ceppi; Questa tecnica può essere adattata per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie.

Abstract

Metodi tipici per la delucidazione della funzione di un gene particolare coinvolgono analisi comparative fenotipiche del ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto il gene di interesse. Un costrutto di DNA di rottura del gene contenente un gene marcatore di resistenza agli antibiotici adatti è utile per la generazione di ceppi gene-interrotto nei batteri. Tuttavia, metodi di costruzione tradizionali, che richiedono passaggi clonazione genica, coinvolgono protocolli lunghi e complessi. Qui, un metodo relativamente facile, rapido e conveniente per rottura del gene mirati in Streptococcus mutans è descritto. Il metodo utilizza una reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare il costrutto di rottura e l’elettroporazione per trasformazione genetica fusione 2-step. Questo metodo non richiede una reazione enzimatica, diverso da PCR e inoltre offre una maggiore flessibilità in termini di design del costrutto rottura. L’occupazione dell’elettroporazione facilita la preparazione di cellule competenti e migliora l’efficienza di trasformazione. Il presente metodo può essere adattato per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie.

Introduction

Analisi di funzione del gene in genere implica un confronto fenotipico tra un ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto un particolare gene di interesse. Questa tecnica di rottura del gene è stata utilizzata per analisi di funzione del gene in una vasta gamma di taxa, dai batteri ai mammiferi. Un costrutto di rottura del gene è necessario per la generazione del ceppo gene-interrotto; Questo costrutto di acido desossiribonucleico (DNA) consiste del gene marcatore di resistenza agli antibiotici fuso a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del gene target ed è incorporato il genoma tramite ricombinazione omologa. Il ceppo di gene-interrotto può essere isolato utilizzando terreni selettivi che contengono l’antibiotico. Il metodo convenzionale utilizzato per la costruzione del ceppo gene-interrotto richiede operazioni complesse, quali l’amplificazione del gene target da reazione a catena della polimerasi (PCR), legatura del gene in un plasmide adatto, digestione con restrizione enzimi e religation per inserire il gene marcatore di resistenza agli antibiotici. Questo processo è che richiede tempo, prendendo diversi giorni a diverse settimane, a seconda dell’esito di ogni passo. Inoltre, il design dei costrutti di rottura è dipenda sui siti degli enzimi di limitazione del gene target. Per risolvere questi problemi, sono stati segnalati basati su PCR del DNA metodi d’impionbatura^{2 1,}per la progettazione di gene-perturbato mutanti di Dictyostelium discoideum³ e Synechocystis SP. PCC6803⁴ . Nello studio presente, è stato sviluppato un metodo per generare un ceppo streptococcico gene-interrotto in maniera relativamente rapida, facile e poco costoso, che utilizza un metodo basato su PCR modificato (designato fusione 2-step PCR) per la costruzione della perturbazione costrutto ed elettroporazione per trasformazione genetica.

La fusione di 2-step che PCR richiede DNA genomic, gene marcatore di resistenza agli antibiotici come un modello PCR e quattro coppie di opportunamente progettato gli iniettori del oligonucleotide. Nella prima fase (1^st PCR), una regione di accompagnamento 1 kb a Monte del gene target, una regione di fiancheggiamento 1 kb a valle della destinazione gene e gene marcatore di resistenza agli antibiotici sono amplificati mediante PCR. Regioni 5′ sia il primer reverse e il primer in avanti, per l’amplificazione della a Monte e a valle delle regioni, fiancheggianti rispettivamente, includono 15 basi complementari fino agli estremi confini del gene marcatore. 5′ regioni di sia forward e reverse primer per l’amplificazione del gene marcatore Analogamente includono 15 basi complementari all’estremità inferiore della regione di fiancheggiamento a Monte del gene dell’obiettivo e l’estremità superiore della regione di fiancheggiamento a valle del gene target, rispettivamente. Di conseguenza, i tre frammenti amplificati contengono regioni sovrapposte di coppia 30-base presso il sito di fusione. Nella seconda fase (2^nd PCR), PCR viene eseguita con gli iniettori PCR annidati utilizzando i tre frammenti amplificati da 1^st PCR come modelli. Le regioni complementari dei modelli sono inoltre collegate tra loro tramite la 2^nd PCR. Infine, il costrutto per ricombinazione omologa è stato introdotto al ceppo selvaggio-tipo di elettroporazione. Successo del gene può essere verificato mediante PCR utilizzando primers specifici. Anche se il costrutto di rottura è amplificato utilizzando ad alta fedeltà della polimerasi del DNA, ulteriori reazioni enzimatiche, come la legatura del DNA o digestione del DNA, non sono necessari per generare il costrutto. Inoltre, una regione eliminata o conservata sul genoma può essere scelti in modo flessibile secondo il disegno dell’iniettore.

Nel presente lavoro, l’eliminazione di intera regione di codificazione del gene gtfC , che codifica glucosiltransferasi in Streptococcus mutans, è stata eseguita per illustrare il metodo di rottura rapida, facile gene in una specie streptococciche. Inoltre, un gtfB-ceppo interrotta è stato generato nello stesso modo. Il glucosyltransferases codificati da sia gtfC e gtfB contribuiscono a cariogeni biofilm dentale sviluppo^5,6. Le abilità che formano biofilm del selvaggio-tipo di ceppo (S. mutans WT), gtfC-interrotto ceppo (S. mutans ΔgtfC) e gtfB-ceppo perturbato (S. mutans ΔgtfB) sono stati valutati per analisi fenotipiche comparative. Questo protocollo si estende l’applicazione di un metodo in due fasi per rottura del gene ad un’altre specie e può essere modificato per gli studi di funzione del gene in una gamma più ampia di taxa.

Protocol

1. primer Design preparare primer per fusione di 2-step PCR e verifica della rottura del gene. Nota: La tabella 1 Mostra le sequenze dell’iniettore utilizzate nel presente protocollo. la figura 1 Mostra un’illustrazione schematica del metodo PCR 2-passo fusione utilizzato per generare S. mutans Δ gtfC. Primer design per la sostituzione dell’area di destinazione del genoma con la spectinomicina-resistenza gene (<…

Representative Results

La figura 2 Mostra che la dimensione di ciascun prodotto dal 1st PCR, come osservato su gel di agarosio all’1%, era in buon accordo con la dimensione prevista di circa 1 kb. La figura 3 Mostra l’analisi di elettroforesi del gel dei prodotti della 2nd PCR. La figura 4 Mostra S. mutans colonie trasformate con il costrutto di rottura e un’analisi di elettroforesi del gel d…

Discussion

Nel presente protocollo, i primers per la 1^st PCR devono essere progettati per amplificare circa 1 kb a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del regione di destinazione nel genoma. Tali sequenze fiancheggianti lungo sono necessari per migliorare l’efficienza di ricombinazione omologa.

Le sequenze dei primer (up-reverse, giù-avanti, spc^r-avanti e spc^r-inversa) in questo protocollo sono stati automaticamente determinati basato sul sito …

Materials

Streptococus mutans	Stock strain in the lab.		Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit	Zymo Research	D6005
Bead-beating disruption apparatus	Taitec	GM-01
Synthetic genes	Eurofins Genomics	Custom-ordered	Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler	Astec	PC-708
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered	35 bases in length
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Electroporation cuvette	Bio-rad	1652086	0.2-cm gap
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture media
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics
Erythromycin	Wako	057-07151	Antibiotics
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining