تحليل إعادة تشكيل أورجانويد (ORA) للتحليل الوظيفي الجذعية المعوية وخلايا متخصصة
Summary
تنشأ من أقبية كله الثقافات أورجانويد المعوية ولا تسمح التحليل الذاتي تجديد والتمايز بطريقة خاصة بالخلية. ويصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل الجذعية تم فرزها (Lgr5+) ومكانه الخلايا (بانته)، والتي تؤدي إلى أورجانويدس حين تمكينهم من قبل التعديل البيوكيميائية والوراثية والتحليل الوظيفي.
Abstract
ظهارة الأمعاء تتميز بمعدل دوران سريع للغاية. في الثدييات، ويتم تجديد البطانة الظهارية الكامل خلال 4-5 أيام. الخلايا الجذعية البالغة المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا Lieberkühn، وتخصص بالتعبير عن الجين Lgr5 ، والحفاظ على التوازن من خلال ما مميزة ارتفاع معدل التكاثري1. في جميع أنحاء الأمعاء، Lgr5+ يختلط الخلايا الجذعية مع الخلايا الافرازية المتخصصة تسمى الخلايا بانته. بانته الخلايا تفرز المركبات المضادة للبكتيريا (أيليسوزيمي وكريبتدينس/ديفينسينس)، وممارسة دور المسيطر على النباتات المعوية. في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف وظيفة جديدة للخلايا بانته، وهي قدرتها على توفير الدعم المتخصصة بالخلايا الجذعية Lgr5+ من خلال عدة يغاندس الرئيسية ك Wnt3 ولو Dll12.
عندما عزل السابقين فيفو ومثقف حضور عوامل نمو محددة وعناصر المصفوفة خارج الخلية، الخبايا المعوية كله يؤدي إلى المعمرة والذاتي تجديد هياكل ثلاثية الأبعاد تسمى أورجانويدس التي تشبه جداً السرداب-زغابة هندسة الظهارية من الكبار الأمعاء الدقيقة3. الثقافات أورجانويد، عندما أنشأت من أقبية كله، تسمح دراسة التجديد الذاتي، والتفريق بين مكانة الخلايا الجذعية المعوية، على الرغم من دون التصدي لمساهمة مكوناتها الفردية، إلا وهي Lgr5+ و الخلايا بانته.
هنا، نحن تصف نهجاً جديداً للانزيم أورجانويد أن يستفيد من قدرة بانته و Lgr5+ الخلايا للمنتسبين وشكل أورجانويدس عندما شارك مثقف. هذا النهج، الذي يشار إليه هنا “أورجانويد إعادة الفحص” (أورا)، يسمح بتعديل الوراثية والبيوكيميائية بانته أو Lgr5+ الخلايا الجذعية، تليها إعادة تشكيل في أورجانويدس. على هذا النحو، فإنه يسمح للتحليل الوظيفي للعنصرين الرئيسيين في مكانة الخلايا الجذعية المعوية.
Introduction
ظهارة الأمعاء هو الأكثر سرعة الذاتي تجديد الأنسجة في جسم الثدييات، وقد تم على هذا النحو، هدفا لعدد كبير دراسات الرامية إلى تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية البالغة الذين يقيمون في الجزء السفلي من سرداب من Lieberkühn، اعتماداً على إشارات Wnt المتعارف عليه1والمخصصة بالتعبير عن الجين Lgr5 . جدير بالذكر أن الخلايا الجذعية Lgr5+ الذي كان واقفاً وتدعمها الخلايا المتخصصة المتخصصة، أي خلايا بانيث، التي تعتمد أيضا على Wnt يدل على نضوج2. معا، هذه أنواع الخلايا اثنين تكمن وراء الذاتي تجديد البطانة الظهارية المعوية والحفاظ على توازن التماثل الساكن اليومي: Lgr5+ تقسيم الخلايا الجذعية سريعاً، وأن تؤدي إلى السلف وأكثر تخصصا الأمعاء الظهارية الخلايا؛ خلايا بانته توفر عوامل أساسية متخصصة (مثلاً، لو Dll1، Wnt3،) إلى Lgr5+ الخلايا الجذعية2. تم استغلاله كأداة تجريبية لتوفير نظرة ثاقبة العمليات مثل الذاتي تجديد قدرة الخبايا المعوية عند مطلي السابقين فيفو لتشكيل هياكل المنظمة وتجديد ذاتي يسمى أورجانويدس، أو “ميني-الشجاعة”، و التباين في الظروف العادية والمرضية بما في ذلك السرطان4. وقد أقيمت الثقافات أورجانويد من أنسجة عدة، بما في ذلك الأمعاء، البنكرياس، والكبد والكلى، ومن الماوس والعينات البشرية4. طريقة استخراج وعوامل النمو المستخدمة لتطوير هذه الثقافات أورجانويد الخاصة بالانسجة والمصممة لدفع التمايز النسب المتعددة وتحاكي أكبر قدر ممكن من الخلايا الجذعية مكانة الأصلي المجراة في. وقد أورجانويدس التطبيقات المحتملة بما في ذلك معالجة الأمراض الوراثية، وتقييم الفعالية العلاجية في السرطان، وتحليل المخدرات سمية، أو دراسة organogenesis في المختبر5.
عموما، القيد الرئيسي للثقافات أورجانويد عندما أنشأت من عينات الأنسجة عدم التحديد في الخلية. على سبيل المثال، لا تسمح أورجانويدس المعوية المنشأة من الخبايا المعوية كله تحليل المكونات الخلوية الفردية ضمن المصدر الأنسجة (مثلاً، تحتوي على الأقبية كلها Lgr5+، بانته، و الخلايا السلف).
هنا، يمكننا وصف أسلوب رواية، يشار إلى أورا، الذي يجمع بين مزايا الثقافات أورجانويد المعوية مع التحليل الوظيفي لعناصرها الأساسية، إلا وهي الجذعية (Lgr5+) والخلايا المتخصصة (بانته). ويتحقق ذلك من خلال قدرة فريدة من نوعها بانيث والخلايا Lgr5+ المنتسبين فعلياً مع بعضها البعض عندما شارك المحتضنة وتؤدي إلى أورجانويدس2،،من610. ونحن استغل هذه الميزة وقبل يعامل أنواع الخلايا اثنين على حدة قبل السماح لهم بتشكيل أورجانويدس. عند القيام بذلك، يمكن أن يتعرض كل مكون من مكونات الخلية لأي المخدرات معين أو عامل النمو، مثبط البيوكيميائية، التعديل الوراثي أو العلاج الكيميائي قبل إعادة تشكيل وتكوين أورجانويد. ولذلك، استخدام مقايسة أورا سوف تسمح للبت في ما إذا كان العلاج من المخدرات محددة أو التحوير الوراثي له تأثير محددة على الخلايا الجذعية أو نظيرتها المتخصصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أورا يسمح التحليل الوظيفي المكرر المكونات الأساسية اثنين من مكانة المعوية الخلايا الجذعية، هي خلايا بانته و Lgr5+ . هذا النهج قد استخدمت سابقا من قبل لنا ولغيرنا مع تعديلات طفيفة6،،من1011. نقدم هنا، الإجراء أورا كبروتوكول مختبر اس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأمكن هذه الدراسة بتمويل من “جمعية السرطان الهولندية” (كوف؛ EMCR 2012-5473) و “العالم السرطان البحث الصناديق الدولية” (WCRF؛ المشروع رقم 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
