Organoid rekonstitution Assay (ORA) for den funktionelle analyse af Intestinal stilk og Niche celler

Summary

Tarm organoid kulturer er etableret fra hele krypter og tillader ikke, at analysen af selvfornyelse og differentiering i en celle-specifikke mode. Denne protokol beskriver rekonstituering af sorterede stilk (Lgr5⁺) og niche (Paneth) celler, som giver anledning til organoids samtidig med at deres forudgående biokemiske og genetiske modifikation og funktionelle analyse.

Abstract

Den intestinale epitel er karakteriseret ved en meget hurtig omsætningshastighed. Hos pattedyr, er hele epithelial foring fornyes inden for 4-5 dage. Tarm stamceller fra voksne bor i bunden af Krypter af Lieberkühn, er øremærket ved ekspression af Lgr5 -gen og bevare homøostase gennem deres karakteristiske høje proliferativ sats¹. I hele tyndtarmen, Lgr5⁺ stamceller er sammenblandet med specialiserede sekretoriske celler kaldet Paneth cellerne. Paneth celler udskiller antibakterielle stoffer (dvs., lysozym og cryptdins/defensins) og udøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. For nylig, en ny funktion er blevet opdaget for Paneth cellerne, nemlig deres kapacitet til at niche støtte Lgr5⁺ stamceller gennem flere centrale ligander som Wnt3, EGF og Dll1².

Når isoleret ex vivo og kulturperler bestemte vækstfaktorer og ekstracellulære matrix komponenter, hele tarm Krypter give anledning til langlivede og selvstændig fornyelse 3D strukturer kaldet organoids, der meget ligner krypt-villus epitelial arkitektur af voksen tyndtarmen³. Organoid kulturer, når etableret fra hele Krypter, tillade studiet af selvfornyelse og differentiering af den intestinale stamcelle niche, uden dog at tackle bidrag af dens enkelte komponenter, nemlig Lgr5⁺ og Paneth cellerne.

Her, vi beskrive en ny tilgang til organoid analysen, der udnytter muligheden i Paneth og Lgr5⁺ celler til at knytte og danne organoids når Co kulturperler. Denne tilgang, betegnes som “organoid rekonstitution assay” (ORA), tillader den genetiske og biokemiske ændring af Paneth eller Lgr5⁺ stamceller, efterfulgt af rekonstituering i organoids. Som sådan, det giver mulighed for den funktionelle analyse af de to vigtigste komponenter i tarm stamcelle niche.

Introduction

Den intestinale epitel er den mest hurtigt selv fornyelse væv i pattedyr kroppen og som sådan har været genstand for et utal af undersøgelser med henblik på identifikation og funktionel karakterisering af de voksne stamceller bosat nederst i krypten af Lieberkühn, øremærkede ved ekspression af Lgr5 -gen og afhængige af canonical Wnt signaler¹. Især, er Lgr5⁺ stamceller flankeret og støttet af specialiserede niche celler, dvs Paneth cellerne, som også afhænger af Wnt signalering til deres modning². Sammen, disse to celletyper ligge til grund for self-fornyelse af den intestinale epitel foring og bevare den daglige homeostatiske balance: Lgr5⁺ stamceller hurtigt dividere og give anledning til Stamform og mere specialiseret intestinale epitel celler; Paneth cellerne give væsentlige niche faktorer (f.eks.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5⁺ stilk celler². Kapacitet af intestinal Krypter når forgyldt ex vivo til at danne organiseret og selvstændig fornyelse strukturer kaldes organoids, eller “mini-modet”, er blevet udnyttet som en eksperimentel redskab til at give indsigt i processer som selvfornyelse og differentiering i normale og patologiske betingelser herunder kræft⁴. Organoid kulturer har været etableret fra flere væv, herunder tarm, bugspytkirtel, lever og nyrer, fra både musen og menneskelige prøver⁴. Metoden udvinding og vækstfaktorer ansat til at udvikle disse organoid kulturer er væv-specifikke og designet til at køre flere lineage differentiering og efterligner så tæt som muligt de oprindelige stamceller niche in vivo. Organoids kan have potentielle applikationer, herunder behandling af genetiske sygdomme, vurderingen af den terapeutiske virkning i kræft, analyse af lægemiddeltoksicitet eller studiet af organogenesis in vitro-⁵.

Samlet set er den største begrænsning af organoid kulturer når etableret fra vævsprøver manglende celle-specificitet. For eksempel tarm organoids etableret fra hele tarm Krypter ikke tillader analyse af enkelte cellulære komponenter omfattede inden for væv kilde (f.eks.hele Krypter indeholder Lgr5⁺, Paneth, og stamceller).

Her, beskriver vi en roman metode, betegnes som ORA, der kombinerer fordelene ved tarm organoid kulturer med den funktionelle analyse af dets mest grundlæggende komponenter, nemlig stilk (Lgr5⁺) og niche (Paneth) celler. Dette opnås gennem en unik evne af Paneth og Lgr5⁺ celler for at fysisk forbinder med hinanden når Co udruget og give anledning til organoids^2,6,10. Vi tog fordel af denne funktion og forbehandlet to celletyper individuelt før den tillader dem at rekonstruere organoids. Når du laver så hver celle komponent kan blive udsat for enhver given stof, vækstfaktor, biokemiske inhibitor, genetisk modifikation eller kemisk behandling inden rekonstitution og organoid dannelse. Derfor vil tillade bruge ORA assay bestemmelse af om en specifik behandling eller genetisk modificering har en specifik virkning på stamcellerne eller deres niche modstykke.

Protocol

Alle procedurer blev gjort lokale dyrevelfærd love og retningslinjer. 1. forberedelse af instrumenter, dyrkningsmedier og retter Autoklave 1 sæt intestinal saks, normal saks og pincet i en steril beholder. Sted en 96-brønd (flad bund) fad i en inkubator ved 37 ° C. Forberede 10 mL af komplet næringssubstratet med de reagenser, der er anført i tabel af materialer. Inkuber den fuldstændige medium ved 37 ° C i et vandbad. Tø rekonstituere…

Representative Results

Organoid rekonstitution assay tillader den separate funktionelle analyse af de væsentlige niche og stamceller komponenter i den intestinale epitel, her vist ved små interfererende RNA (siRNA) af Apc -genet. For at nå dette mål må udnyttet vi først fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) for at adskille 8000 Lgr5+ celler og 6000 Paneth cellerne fra indavlede C57BL6/J mus. I <strong class…

Discussion

ORA tillader den raffinerede funktionel analyse af de to væsentlige komponenter i den intestinale stamcelle niche, nemlig Lgr5⁺ og Paneth cellerne. Denne tilgang har tidligere været ansat ved os og andre med mindre ændringer^6,10,11. Vi præsenterer her, ORA procedure som laboratorier reproducerbare og standardiseret protokol. Også, vi rapport om virkningerne af Apc downregulation i Lgr5<…

Materials

Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Final concentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin *	Peprotech	250-38	Final concentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Final concentration: 10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium