וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה
Summary
תא צורב מעיים תרבויות הוקם מתוך כל כוכים, ואינם מאפשרים הניתוח של התחדשות עצמית ובידול באופן ספציפי תא. פרוטוקול זה מתאר הכינון של גזע ממוינת (Lgr5+), נישה (Paneth) תאים, אשר להצמיח organoids תוך מתן אפשרות שינוי הביוכימי, גנטית מוקדמת שלהם, אנליזה פונקציונלית.
Abstract
האפיתל במעי מאופיין על ידי שיעור תחלופה מהירה בצורה קיצונית. ביונקים, הציפוי אפיתל כולו מתחדש תוך 4-5 ימים. תאי גזע בוגרים מעיים שוכנים בתחתית המופרש אמורים לעבור על ידי ביטוי של הגן Lgr5 , לשמור על הומאוסטזיס באמצעות שלהם האופיינית בקצב גבוה proliferative1. לאורך כל המעי הדק, Lgr5+ תאי גזע שנטוו עם תאים הפרשה מיוחדים הנקראים תאי Paneth. תאי Paneth מפרישים חומרים אנטי בקטריאליים (קרי, ליזוזים ו cryptdins/defensins) ולעשות מאמץ תפקיד השליטה על הפלורה במעיים. לאחרונה, פונקציה הרומן התגלה עבור תאי Paneth, כלומר היכולת שלהם לספק תמיכה נישה לתאי גזע Lgr5+ דרך מספר ליגנדים מפתח Wnt3, EGF ו- Dll12.
כאשר מבודדים לשעבר vivo ותרבותית בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית, כוכים מעיים כל להצמיח מאריכים וקרא עצמית חידוש מבנים תלת-ממד organoids המזכירים מאוד את הקריפטה-סיסי ארכיטקטורה האפיתל של המעי הדק למבוגרים3. תא צורב תרבויות, כאשר הוקמה מתוך כל כוכים, לאפשר המחקר של התחדשות עצמית ובידול של הגומחה תאי המעי, אך ללא התייחסות התרומה של מרכיבים בודדים, כלומר Lgr5+ , תאי Paneth.
כאן, אנו מתארים את הגישה של הרומן וזמינותו תא צורב כי מנצל היכולת של Paneth ו Lgr5+ תאים כדי לשייך ויוצרים organoids כאשר ותרבותית משותפת. גישה זו, המכונים כאן “תא צורב שיחזור assay” (אורה), מאפשרת שינוי גנטי וביוכימי של Paneth או Lgr5+ תאי גזע, ואחריו שיחזור לתוך organoids. ככזו, היא מאפשרת ניתוח תפקודי של שני מרכיביה העיקריים של גומחת תאי גזע מעיים.
Introduction
האפיתל במעי הוא הרקמה ביותר במהירות עצמי המתחדש בגוף יונקים ו, בתור שכזה, היה מושא שפע של מחקרים שמטרתם זיהוי ואפיון פונקציונאלי של תאי גזע בוגרים המתגוררים בחלק התחתון של התת-קרקעי המופרש, תגייס לביטוי של הגן Lgr5 ותלוי ונ ט הקנוני אותות1. ראוי לציין, תאי גזע Lgr5+ מוקף, נתמך על ידי תאים נישה מיוחדים, קרי Paneth תאים, אשר גם תלוי ונ ט איתות שלהם התבגרות2. יחד, מסוגי התאים שני ביסוד התחדשות עצמית של רירית אפיתל המעי, לשמר את האיזון homeostatic יומי: Lgr5+ תאי גזע במהירות לחלק, להצמיח קדמון, יותר והתמחה מעיים אפיתל תאים; תאי Paneth לספק נישה חיוני גורמים (למשל, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ גזע תאים2. הקיבולת של מעיים כוכים כאשר מצופה ex-vivo כדי ליצור מבנים מאורגנים עצמי המתחדש שנקרא organoids, או “מיני-אומץ”, נוצלה ככלי ניסיוני כדי לספק תובנות תהליכים כגון התחדשות עצמית, בידול בתנאים נורמליים ופתולוגיים כולל סרטן4. תא צורב תרבויות הוקמו מתוך מספר רקמות, לרבות המעי, הלבלב, הכבד, הכליה, העכבר והן דוגמאות האנושי4. שיטת החילוץ של גורמי גדילה המועסקים לפתח תרבויות תא צורב אלה הם רקמות ספציפיות נועד כונן מרובה שושלת היוחסין בידול ואת לחקות ככל האפשר את גומחת תאי גזע המקורי ויוו. Organoids ייתכן יישומים אפשריים כולל הטיפול של מחלות גנטיות, להערכת יעילות טיפולית בסרטן, הניתוח של רעילות התרופה או המחקר של organogenesis במבחנה5.
הכולל, המגבלה העיקרית של תרבויות תא צורב כאשר נוצרו מדגימות רקמה הוא חוסר תא-ירידה לפרטים. לדוגמה, מעיים organoids נוצרו מכוכים מעיים כל אינם מאפשרים הניתוח של רכיבים בודדים הסלולר הקיף בתוך המקור רקמות (למשל, מכילים כוכים כל Lgr5+, Paneth, ו ובתאים).
כאן, אנו מתארים שיטה, המכונה אורה, המשלבת את היתרונות של תרבויות תא צורב מעיים עם ניתוח תפקודי של מרכיביו הבסיסיים ביותר, כלומר גזע (Lgr5+) ותאים נישה (Paneth). זו מושגת באמצעות היכולת הייחודית של Paneth, Lgr5+ תאים לשיוך פיזית עם אחד לשני כאשר שיתוף מודגרות להצמיח organoids2,6,10. אנו ניצלו תכונה זו, טרום טיפול בנפרד את סוגי תאים שני מתנים את אותם צריך להשרות organoids. תוך כדי כל רכיב תא תיחשף כל נתון סמים, פקטורי גדילה, מעכב הביוכימי, ההנדסה הגנטית או טיפול כימי לפני שיחזור ויצירת תא צורב. לכן, שימוש וזמינותו אורה יאפשר הקביעה של הטיפול בתרופה מסוימת או ההנדסה הגנטית יש אפקט מסוים על תאי גזע או עמיתו הנישה שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
אורה מאפשר ניתוח פונקציונלי מעודן של שני מרכיבים חיוניים של הגומחה תאי המעי, כלומר Lgr5+ ותאי Paneth. גישה זו כבר מועסקים בעבר עם שינויים קלים6,10,11מאת, ואחרים. כאן, אנו מציגים את ההליך אורה כפרוטוקול מעבדה מתוקננת הדירים. בנוסף, אנחנו ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה התאפשר על ידי מימון ההולנדי האגודה למלחמה בסרטן (KWF; EMCR 2012-5473) את העולם סרטן מחקר קרנות הבינלאומי (WCRF; פרויקט מס ‘ 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
