आंत्र स्टेम और आला कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए Organoid पुनर्गठन परख (ORA)
Summary
आंतों organoid संस्कृतियों पूरे तहखाने से स्थापित कर रहे हैं और एक सेल विशेष फैशन में आत्म नवीकरण और भेदभाव के विश्लेषण की अनुमति नहीं है । इस प्रोटोकॉल हल स्टेम (Lgr5+) और आला (Paneth) कोशिकाओं है, जो organoids को जंम देते समय उनके पहले जैव रासायनिक और आनुवंशिक संशोधन और कार्यात्मक विश्लेषण को सक्षम करने के पुनर्गठन का वर्णन करता है ।
Abstract
आंतों उपकला एक अत्यंत तेजी से कारोबार की दर की विशेषता है । स्तनधारियों में, पूरे उपकला अस्तर 4-5 दिनों के भीतर नए सिरे से है. वयस्क आंत्र स्टेम कोशिकाओं Lieberkühn के तहखाने के नीचे रहते हैं, Lgr5 जीन की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित हैं, और उनकी विशेषता उच्च प्रफलन दर1के माध्यम से homeostasis की रक्षा । छोटी आंत के दौरान, Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं विशेष स्रावी कोशिकाओं Paneth कोशिकाओं कहा जाता है के साथ मिश्रित कर रहे हैं । Paneth कोशिकाओं जीवाणुरोधी यौगिकों (यानी, lysozyme और cryptdins/defensins) स्रावित और आंतों वनस्पति पर एक नियंत्रित भूमिका डालती है । अभी हाल ही में, एक उपंयास समारोह Paneth कोशिकाओं के लिए खोज की गई है, अर्थात् उनकी क्षमता के लिए आला समर्थन प्रदान करने के लिए Lgr5+ स्टेम सेल Wnt3, EGF, और Dll12के रूप में कई महत्वपूर्ण लाइगैंडों के माध्यम से ।
जब अलग पूर्व vivo और विशिष्ट विकास कारकों और extracellular मैट्रिक्स घटकों की उपस्थिति में प्रसंस्कृत, पूरे आंत्र तहखाना लंबे समय तक रहने वाले और आत्म नवीकरण 3 डी संरचनाओं को जन्म दे organoids कहा जाता है कि अत्यधिक तहखाने-अंकुर समान वयस्क छोटी आंत की उपकला वास्तुकला3. Organoid संस्कृतियों, जब पूरे तहखाने से स्थापित, स्व के अध्ययन के नवीकरण और आंत्र स्टेम सेल आला के भेदभाव की अनुमति है, हालांकि इसके व्यक्तिगत घटकों के योगदान को संबोधित कर के बिना, अर्थात् Lgr5+ और Paneth कक्ष ।
यहां, हम organoid परख के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण का वर्णन है कि Paneth और Lgr5+ कोशिकाओं की क्षमता का लाभ लेता है सहयोगी और organoids के रूप में जब सह संस्कृति । इस दृष्टिकोण, यहां के रूप में संदर्भित करने के लिए “organoid पुनर्गठन परख” (ORA), आनुवंशिक और जैव रासायनिक संशोधन की अनुमति देता है Paneth या Lgr5+ स्टेम सेल, organoids में पुनर्गठन के बाद । जैसे, यह आंत्र स्टेम सेल आला के दो मुख्य घटकों के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है ।
Introduction
आंतों उपकला स्तनधारी शरीर में सबसे तेजी से आत्म नवीकरण ऊतक है और, इस तरह के रूप में, तहखाने के तल पर रहने वाले वयस्क स्टेम कोशिकाओं की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के उद्देश्य से अध्ययन के ढेर सारे की वस्तु किया गया है Lieberkühn की, निर्धारित की अभिव्यक्ति द्वारा Lgr5 जीन और विहित Wnt संकेतों पर निर्भर1. विशेष रूप से, Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं और पार्श्व विशेष आला कोशिकाओं, यानी Paneth कोशिकाओं है, जो भी उनकी परिपक्वता2के लिए संकेत Wnt पर निर्भर द्वारा समर्थित हैं । एक साथ, इन दो कोशिका प्रकार आबाद आंत्र उपकला अस्तर के स्व-नवीकरण और दैनिक समस्थिति संतुलन की रक्षा: Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं तेजी से विभाजित और जनक और अधिक विशेष आंत्र उपकला को जन्म दे कोशिकाओं; Paneth कोशिकाओं आवश्यक आला कारकों (जैसे, Dll1, Wnt3, EGF) प्रदान करने के लिए Lgr5+ स्टेम सेल2। आंतों तहखाने की क्षमता जब चढ़ाया पूर्व vivo को संगठित और स्व-नवीकरण संरचनाओं organoids, या “मिनी हिंमत” कहा जाता है, एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में ऐसे स्व के रूप में प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के नवीकरण और शोषण किया गया है 4कैंसर सहित सामान्य और रोग की स्थिति में भेदभाव. Organoid संस्कृतियों कई ऊतकों से स्थापित किया गया है, आंत सहित, अग्ंयाशय, जिगर, और गुर्दे, दोनों माउस और मानव नमूने4से । निष्कर्षण विधि और विकास के लिए इन organoid संस्कृतियों के विकास के लिए कार्यरत कारकों ऊतक विशिष्ट है और बहु वंश भेदभाव ड्राइव और के रूप में संभव के रूप में मूल स्टेम सेल आला vivo में नकल करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । Organoids आनुवंशिक रोगों के उपचार सहित संभावित अनुप्रयोगों हो सकता है, कैंसर में चिकित्सीय प्रभावकारिता का आकलन, दवा विषाक्तता के विश्लेषण, या organogenesis के अध्ययन इन विट्रो में5.
कुल मिलाकर, organoid संस्कृतियों की मुख्य सीमा जब ऊतक नमूनों से स्थापित सेल विशिष्टता की कमी है । उदाहरण के लिए, आंतों organoids पूरे आंत्र तहखाना से स्थापित व्यक्तिगत सेलुलर घटकों के विश्लेषण ऊतक स्रोत के भीतर शामिल की अनुमति नहीं देते (उदा., पूरे तहखाना होते हैं Lgr5+, Paneth, और जनक कक्ष) ।
यहां, हम एक उपंयास विधि का वर्णन, ORA के रूप में संदर्भित, कि अपने सबसे बुनियादी घटकों के कार्यात्मक विश्लेषण के साथ आंत्र organoid संस्कृतियों के लाभों को जोड़ती है, अर्थात् स्टेम (Lgr5+) और आला (Paneth) कोशिकाओं । यह Paneth और Lgr5+ कोशिकाओं की अद्वितीय क्षमता के माध्यम से प्राप्त की है शारीरिक रूप से एक दूसरे के साथ सहयोगी जब सह-मशीन और organoids को जंम देने के लिए2,6,10। हम इस सुविधा का लाभ लिया और पूर्व उंहें organoids पुनर्गठन की अनुमति देने से पहले दो सेल प्रकार व्यक्तिगत रूप से इलाज किया । ऐसा करने पर, प्रत्येक कोशिका घटक को पुनर्गठन और organoid गठन से पहले किसी भी दवा, विकास कारक, जैव रासायनिक अवरोधक, आनुवंशिक संशोधन, या रासायनिक उपचार से अवगत कराया जा सकता है । इसलिए, ORA परख का उपयोग कर कि एक विशिष्ट दवा उपचार या आनुवंशिक संशोधन स्टेम सेल या उनके आला समकक्ष पर एक विशिष्ट प्रभाव है के निर्धारण की अनुमति देगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ORA आंत्र स्टेम सेल आला, अर्थात् Lgr5+ और Paneth कोशिकाओं के दो आवश्यक घटकों के परिष्कृत कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है । यह दृष्टिकोण पहले हमारे और मामूली संशोधनों6,10,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन डच कैंसर सोसायटी (KWF से धन द्वारा संभव बनाया गया था; EMCR 2012-5473) और विश्व कैंसर अनुसंधान कोष अंतर्राष्ट्रीय (WCRF; परियोजना सं 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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