장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

요약

장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5⁺)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

초록

장 상피는 매우 빠른 회전 속도 의해 특징입니다. 포유류에서 전체 상피 안 대기는 4-5 일 이내에 갱신 됩니다. 성인 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 하단에, Lgr5 유전자의 표현에 의해 배정 있으며 그들의 특성 높은 증식 속도¹통해 항상성 유지. 작은 창 자에 걸쳐 Lgr5⁺ 줄기 세포 Paneth 세포 라고 하는 특수 분 비 세포와 혼합 된. Paneth 세포 항균 화합물 (즉, lysozyme과 cryptdins/defensins) 분 비와 창 자 식물에 제어 역할을 발휘. 더 최근에, 소설 함수 Paneth 세포, 즉 그들의 용량을 Wnt3, EGF, 및 Dll1²로 몇 가지 주요 ligands 통해 Lgr5⁺ 줄기 세포 틈새 지원 제공에 대 한 발견 되었습니다.

전 비보 를 격리 하 고 특정 성장 인자와 세포 외 기질 구성 요소 존재 양식, 전체 장 지하실을 일으키 긴와 매우 유사한 크립 트 모 organoids 라는 자체 3D 구조를 갱신 성인 소장³의 상피 아키텍처입니다. Organoid 문화, 전체 지하실에서 설치 될 때 비록 그것의 개별 구성 요소, 즉는 Lgr5⁺ 의 기여를 해결 하지 않고 자기 갱신의 연구와 장 줄기 세포 틈새의 허용 및 Paneth 세포입니다.

여기, organoid 분석 결과 Paneth의 능력을 활용 하는 새로운 접근 방식을 설명 및 Lgr5⁺ 연결 하 고 organoids 형성을 셀 때 공동 경작. 이 이렇게, 여기 "organoid 재구성 분석 결과" 라고 (오 라), Paneth 유전 그리고 생 화 확 적인 수정할 수 있게 또는 Lgr5⁺ organoids로 재구성 뒤 줄기 세포. 따라서, 장 줄기 세포 틈새의 두 가지 주요 구성 요소 기능 분석을 수 있습니다.

서론

장 상피 포유류 몸에 있는 가장 빠르게 자기 갱신 조직 그리고, 따라서, 식별 및 크립 트의 하단에는 성인 줄기 세포의 기능적 특성을 겨냥 하는 연구의 과다의 개체 Lieberkühn, Lgr5 유전자의 표현에 의해 갑니다 고 정식 Wnt 신호¹의 특히, Lgr5⁺ 줄기 세포 형벌 이며 전문된 틈새 세포, 즉 Paneth 세포, 또한 그들의 성숙²Wnt 신호에 의존 하는 의해 지원. 함께, 이러한 두 셀 형식 자체-갱신 창 자 상피 안 대기의 기초 및 일일 homeostatic 균형 유지: Lgr5⁺ 줄기 세포는 급속 하 게 분할 하 고 뿌리를 및 더 많은 전문 장 상피 셀; Paneth 세포 제공 필수 틈새 요인 (예를 들어, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5⁺ 줄기 세포². 장 지하실 때 도금 비보 전 조직과 자체 갱신 구조를 형성 하기 위하여 organoids, 또는 "미니-배 짱", 용량 자체 갱신 등 프로세스에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험 도구로 이용 되 고 암

프로토콜

모든 절차는 로컬 동물 복지 법률과 지침에 따라 수행 되었다.

1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비

1. 장가 위, 일반가 위, 및 살 균 컨테이너에 집게의 압력솥 1 세트.
2. (플랫 바닥) 96 잘 접시 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치
3. 시 약 재료의 테이블에 나열 된 완전 한 문화 매체의 10 mL를 준비 합니다.
4. 물 욕조에 37 ° C에서 완전 한 매체를 품 어.
5. 해 동 한 얼음 양동이에 그것을 배치 하 여 지하실 멤브레인을 재구성 된다. 재구성 된 지하실 막 4 ° C에 액체 될 것입니다.
6. 인산 염 버퍼 차가운 식 염 수 또는 약식된 PBS (4 ° C)로 4 접시를 채우십시오.

2입니다. 작은 창 자 지하실의 격리

1. Lgr5-eGFP IRES 있다^t2 마우스 C57BL6/J 배경에 CO₂ 흡입에 의해 희생. 가 위 쌍 복 경도 해 부.
2. 집게와 위를 누른 종횡 반으로 잘라.
3. 이제 장가 위를 사용 하 여, 내장을 꺼내 고 PBS를 포함 하는 페 트리 접시에 놓습니다.<....

결과

Organoid 재구성 분석 결과 Apc 유전자의 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 증명 여기 장 상피의 필수 틈새 및 줄기 세포 구성 요소의 별도 기능 분석을 수 있습니다.

이 목표를 달성 하기 위해 우리는 먼저 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 타고 난된 C57BL6/J 쥐에서 8000 Lgr5⁺ 세포와 6000 Paneth 세포를 분리 하 활용. 그림 1a또는 분석 결과의 순서도 그려져 있습니다. Organoid 재구성 용량 siRNA oligonucleotides Apc 의 mRNA에 대 한 감독과 Lgr5⁺ 세포를 배양 하 여 평가 되었다 또는 컨트롤로 스크램블된 시퀀스 (SCR)을 포괄........

토론

오 라는 두 가지 필수 구성 요소 장 줄기 세포 틈새의 즉 Lgr5⁺ 그리고 Paneth 세포의 세련 된 기능 분석을 허용 한다. 이 방법은 이전 우리와 다른 사람에 의해 약간의 수정^6,,1011를 고용 하고있다. 여기, 재현할 수 및 표준화 된 실험실 프로토콜 또는 프로시저 선물이. 또한, 우리 유전자 구현의 가능성의 예를 들어 Lgr5⁺ 줄기 세포, Apc downregulation의 효과에 보고 (또는 생화학⁶) 정렬된 세포 구성 요소에 대 한 수정. 데이터는 siRNA를 표시 하는, 증가 organoid 복합성 (그림 1B)에 의해 표시 된 대로 Apc 의 중.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
글루타맥스 *	Thermo Fisher Scientific	35050061	최종 농도: 10 mM
페니실린/스트렙토마이신 *	Thermo Fisher Scientific	15140122	최종 농도: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	최종 농도: 10 mM
재조합 쥐 EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	최종 농도: 50ng/ml
재조합 쥐 Noggin *	Peprotech	250-38	최종 농도: 100ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	최종 농도: 10 &마이크로; M
들쭉날쭉 한 -1 *	Anaspec Bio	AS-61298	최종 농도 : 1 µ M
재조합 쥐 R-spondin *	R& D systems	3474-RS-050	최종 농도: 1 mg/ml
Flexitube 유전자 용액 siRNA APC	Qiagen	GS11789	최종 농도: 100 nM
리포펙타민 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	코닝	356230
* 이러한 시약의 조합은 완전한 배양 배지

102424를 구성합니다.