장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)
Summary
장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.
Abstract
장 상피는 매우 빠른 회전 속도 의해 특징입니다. 포유류에서 전체 상피 안 대기는 4-5 일 이내에 갱신 됩니다. 성인 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 하단에, Lgr5 유전자의 표현에 의해 배정 있으며 그들의 특성 높은 증식 속도1통해 항상성 유지. 작은 창 자에 걸쳐 Lgr5+ 줄기 세포 Paneth 세포 라고 하는 특수 분 비 세포와 혼합 된. Paneth 세포 항균 화합물 (즉, lysozyme과 cryptdins/defensins) 분 비와 창 자 식물에 제어 역할을 발휘. 더 최근에, 소설 함수 Paneth 세포, 즉 그들의 용량을 Wnt3, EGF, 및 Dll12로 몇 가지 주요 ligands 통해 Lgr5+ 줄기 세포 틈새 지원 제공에 대 한 발견 되었습니다.
전 비보 를 격리 하 고 특정 성장 인자와 세포 외 기질 구성 요소 존재 양식, 전체 장 지하실을 일으키 긴와 매우 유사한 크립 트 모 organoids 라는 자체 3D 구조를 갱신 성인 소장3의 상피 아키텍처입니다. Organoid 문화, 전체 지하실에서 설치 될 때 비록 그것의 개별 구성 요소, 즉는 Lgr5+ 의 기여를 해결 하지 않고 자기 갱신의 연구와 장 줄기 세포 틈새의 허용 및 Paneth 세포입니다.
여기, organoid 분석 결과 Paneth의 능력을 활용 하는 새로운 접근 방식을 설명 및 Lgr5+ 연결 하 고 organoids 형성을 셀 때 공동 경작. 이 이렇게, 여기 “organoid 재구성 분석 결과” 라고 (오 라), Paneth 유전 그리고 생 화 확 적인 수정할 수 있게 또는 Lgr5+ organoids로 재구성 뒤 줄기 세포. 따라서, 장 줄기 세포 틈새의 두 가지 주요 구성 요소 기능 분석을 수 있습니다.
Introduction
장 상피 포유류 몸에 있는 가장 빠르게 자기 갱신 조직 그리고, 따라서, 식별 및 크립 트의 하단에는 성인 줄기 세포의 기능적 특성을 겨냥 하는 연구의 과다의 개체 Lieberkühn, Lgr5 유전자의 표현에 의해 갑니다 고 정식 Wnt 신호1의 특히, Lgr5+ 줄기 세포 형벌 이며 전문된 틈새 세포, 즉 Paneth 세포, 또한 그들의 성숙2Wnt 신호에 의존 하는 의해 지원. 함께, 이러한 두 셀 형식 자체-갱신 창 자 상피 안 대기의 기초 및 일일 homeostatic 균형 유지: Lgr5+ 줄기 세포는 급속 하 게 분할 하 고 뿌리를 및 더 많은 전문 장 상피 셀; Paneth 세포 제공 필수 틈새 요인 (예를 들어, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ 줄기 세포2. 장 지하실 때 도금 비보 전 조직과 자체 갱신 구조를 형성 하기 위하여 organoids, 또는 “미니-배 짱”, 용량 자체 갱신 등 프로세스에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험 도구로 이용 되 고 암4를 포함 하 여 정상 및 병 적인 조건에서 차별화. Organoid 문화 소장, 췌 장, 간, 그리고 신장, 마우스 및 인간의 샘플4에서 포함 하 여 여러 조직에서 설립 되었습니다. 추출 방법 및 성장 요인이 organoid 문화를 개발 하는 조직 및 다중 계보 차별화를 운전 하 고 최대한 원래 줄기 세포 틈새를 모방 하도록 설계 된 vivo에서. Organoids는 유전 질환의 치료, 암에서 치료 효능, 약물 독성의 분석 또는 생체 외에서organogenesis5의 연구의 평가 포함 하 여 잠재적인 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
전반적으로, organoid 문화 조직 샘플에서 설립 하는 때의 주요 제한은 세포 특이성의 부족입니다. 예를 들어 장 organoids 전체 장 지하실에서 설립 조직 소스 내 포함 개별 세포 구성 성분의 분석을 허용 하지 않습니다 (예를 들어, 전체 지하실 포함 Lgr5+, Paneth, 그리고 조상 세포)입니다.
여기, 우리 소설 메서드, 오 라로 그것의 가장 기본적인 구성 요소, 즉 줄기 (Lgr5+)와 틈새 (Paneth) 세포의 기능 분석 장 organoid 문화의 장점을 결합 하 여 설명 합니다. 이 Paneth의 독특한 능력을 통해 이루어집니다 그리고 실제로 공동 인 큐베이 팅 및 organoids2,,610을 때 서로 연관 Lgr5+ 세포. 우리는이 기능 활용 하 고 미리 organoids를 다시 구성 하도록 허용 하기 전에 개별적으로 2 개의 세포 유형 취급. 때 이렇게, 특정된 약물, 성장 인자, 생화학 억제제, 유전자 조작, 또는 재구성 및 organoid 형성 전에 화학적 치료 각 셀 구성 요소를 노출 될 수 있습니다. 따라서, 지금 분석 결과 사용 하 여 특정 약물 치료 또는 유전 수정에 줄기 세포 또는 그들의 틈새에 특정 효과 있는지 여부의 결정을 허용할 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오 라는 두 가지 필수 구성 요소 장 줄기 세포 틈새의 즉 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포의 세련 된 기능 분석을 허용 한다. 이 방법은 이전 우리와 다른 사람에 의해 약간의 수정6,,1011를 고용 하고있다. 여기, 재현할 수 및 표준화 된 실험실 프로토콜 또는 프로시저 선물이. 또한, 우리 유전자 구현의 가능성의 예를 들어 <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 (KWF; 네덜란드 암 학회 로부터 자금에 의해 가능 하 게 되었다 EMCR 2012-5473)와 세계 암 연구 기금 국제 (WCRF; 프로젝트 번호 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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