Assay органоид растворения (ОРА) для функционального анализа кишечных стволовых и ниша клеток
Summary
Кишечные органоид культур устанавливаются от всей склепы и не позволяют анализ самообновления и дифференциации в клетки конкретных моды. Этот протокол описывает воссоздание отсортированных стволовых (Lgr5+) и ниши (Paneth) клетки, которые порождают organoids обеспечивая их предыдущие биохимических и генетических изменений и функционального анализа.
Abstract
Кишечного эпителия характеризуется чрезвычайно быстрая текучесть. В млекопитающих весь эпителиальной выстилки обновляется в течение 4-5 дней. Кишечные стволовые клетки находятся в нижней части склепы Lieberkühn, выделяются по экспрессии гена Lgr5 и сохранения гомеостаза через их характерным Высокий пролиферативный1. На протяжении тонкого кишечника Lgr5+ стволовые клетки являются перемешан с специализированными секреторных клеток, называемых Paneth клеток. Paneth клетки секретируют антибактериальных соединений (то есть, лизоцима и cryptdins/дефензинов) и оказывают контрольный роль на кишечную флору. Совсем недавно Роман функция была обнаружена Paneth клеток, а именно их способность обеспечивать поддержку нишу Lgr5+ стволовые клетки через несколько ключевых лигандов как Wnt3, EGF и Dll12.
Когда изолированные ex vivo и культивировали при наличии конкретных факторов роста и компоненты внеклеточного матрикса, весь кишечные крипты порождают долгоживущих и самостоятельного обновления 3D структуры под названием organoids, весьма напоминающие склеп ворсинок Эпителиальный архитектура взрослых тонкой кишки3. Органоид культур, когда создана из всей склепы, позволяют исследования самообновления и дифференцировку стволовых клеток кишечника нишу, хотя без учета вклада ее отдельных компонентов, а именно Lgr5+ и Paneth клетки.
Здесь мы опишем новый подход к assay органоид, который использует способности Paneth и Lgr5+ клетки объединяться и создавать organoids когда совместно культивируемых. Этот подход, здесь называют «органоид воссоздание пробирного» (ОРА), позволяет генетических и биохимических изменений Paneth или Lgr5+ стволовых клеток, после растворения в organoids. Таким образом это позволяет функциональный анализ двух основных компонентов ниши стволовых клеток кишечника.
Introduction
Кишечного эпителия является наиболее быстро самостоятельного обновления тканей в организме млекопитающих и, таким образом, был объектом множества исследований, направленных на выявление и функциональной характеристике стволовых клеток взрослых, проживающих в нижней части склепа из Lieberkühn, целевых, экспрессия гена Lgr5 и зависит от канонических Wnt сигналы1. В частности, Lgr5+ стволовые клетки бокам и поддержке специализированных нишевых клетки, то есть Paneth клетки, которые также зависеть Wnt сигнализации для их созревания2. Вместе, эти типы две клетки лежат в основе самообновлению эпителиальной выстилки кишечника и сохранить ежедневно гомеостатических равновесия: Lgr5+ стволовые клетки быстро разделить и порождают прародителем и более специализированных кишечного эпителия клетки; Paneth клетки обеспечивают ниши основных факторов (например, Dll1, Wnt3, EGF) для Lgr5+ стволовые клетки2. Количество кишечных склепы когда покрытием ex vivo в форме организованных и самостоятельного обновления структуры под названием organoids, или «мини кишки», была использована как экспериментальный инструмент для обеспечения понимания процессов, таких как самообновления и дифференциация в нормальных и патологических условиях, включая рак4. Из нескольких тканей, в том числе кишечника, поджелудочной железы, печени и почек, как мышь, так и человеческих пробах4были созданы органоид культур. Метод добычи и факторы роста, занятых в разработке этих культур органоид ткане- и предназначены для привода мульти линии дифференциации и максимально точно имитировать оригинальные ниши стволовых клеток в vivo. Organoids могут иметь потенциальные приложений, включая лечения генетических заболеваний, оценка терапевтической эффективности в рак, анализ лекарственной токсичности или изучению органогенеза в vitro5.
В целом основным ограничением органоид культурах когда создана из образцов тканей является отсутствие клеток специфика. К примеру, кишечные organoids с целом кишечные крипты не позволяют анализ отдельных клеточных компонентов, входили в источнике ткани (например, содержат весь склепы Lgr5+, Paneth, и клетки-предшественники).
Здесь мы опишем новый метод, именуемый ORA, который сочетает в себе преимущества кишечных органоид культур с функционального анализа его самых основных компонентов, а именно стволовых (Lgr5+) и ниши (Paneth) клетки. Это достигается за счет уникальной способности Paneth и Lgr5+ клетки к физически связаны друг с другом совместно инкубировали при породить organoids2,6,10. Мы воспользовались этой функции и предварительно индивидуально типы двух клеток перед предоставлением им для воссоздания organoids. При этом каждый компонент ячейки могут подвергаться любого данного препарата, фактор роста, биохимические ингибитор, генетической модификации или химической обработки до растворения и органоид формирования. Таким образом используя ORA assay позволит определение о том, имеет ли конкретный препарат лечения или генетической модификации специфическое воздействие на стволовые клетки или их двойники нишу.
Protocol
Representative Results
Discussion
ORA позволяет изысканный функциональный анализ двух основных компонентов ниши стволовых клеток кишечника, а именно: Lgr5+ и Paneth клетки. Этот подход ранее работали с нами и другими с незначительными изменениями6,10,11. Здесь мы пред…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование стало возможным благодаря финансированию из голландского общества рака (KWF; EMCR 2012-5473) и рак исследований средств мирового (WCRF; проект № 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
