Långsiktiga levande Imaging enhet för förbättrad experimentella Manipulation av zebrafisk larver
Summary
Detta manuskript beskriver zWEDGI (zebrafiskar Wounding och brottsprovokation enheten för tillväxt och Imaging), som är en konkurrensbetingat anordning för att orientera och hindra zebrafiskar larver. Designen möjliggör svans transection och långsiktiga samling av högupplösta fluorescerande mikroskopi bilder av sårläkning och förnyelse.
Abstract
Zebrafiskar larven är en viktigt modellerar organism för både utvecklingsbiologi och sårläkning. Dessutom är Sebrafisken larven ett värdefullt system för levande högupplösta mikroskopbilder av dynamiska biologiska fenomen i rymd och tid med cellulära upplösning. Den traditionella metoden av agaros inkapsling för levande avbildning kan dock hindra larval development och vävnad återväxt. Därför detta manuskript beskriver zWEDGI (zebrafiskar Wounding och brottsprovokation enheten för tillväxt och Imaging), som ritades och fabricerade som en funktionellt konkurrensbetingat enhet att orientera larver för högupplösande mikroskopi samtidigt tillåter stjärtfenan transection inom enheten och efterföljande ohämmad svans utveckling och återväxt. Denna enhet möjliggör såra och långsiktiga imaging bibehållen lönsamhet. Eftersom zWEDGI mögel är 3D tryckta, anpassningsbarheten för dess geometrier att det enkelt ändras för olika zebrafiskar bildhanteringsprogram. Dessutom erbjuder zWEDGI många fördelar, såsom tillgång till larven under experiment för sårande eller för tillämpningen av reagenser, parallellt orientering av flera larver för strömlinjeformad imaging och återanvändning av enheten.
Introduction
Zebrafiskar larver Danio rerio regenerativ förmåga gör dem en ideal modellerar organism för att undersöka såret svar samt healing och återväxt1,2,3,4. Tillgång till en matris av transgena zebrafiskar linjer och zebrafiskars anatomiska öppenhet ytterligare förbättra deras nytta för in-vivo studier av såret svar händelser liksom långsiktiga regenerativ processer4. Studera dessa biologiska processer som använder högupplösta time-lapse fluorescensmikroskopi därför kräver en levande zebrafiskar bildenhet som möjliggör hög stabilitet och minimal rörelse av zebrafisk larven bibehållen lönsamhet. Det är avgörande att enheten möjliggör effektiv såra medan läkning och förnyelse inträffar påverkas inte av enheten.
Levande imaging stabilisering standardmetoden för inbäddning larven i agaros under levande imaging begränsar tillväxt och sår regenerering5 och kan öka dödligheten eftersom larverna börjar visa tecken på kardiell stress och vävnad nekros efter fyra timmar4. Därför, borttagning av agaros från områden av intresse är ofta nödvändigt att tillåta normal utveckling och förnyelse6, utsätta larverna till potentiella skada som Agarens skärs bort. Dessutom måste användaren med Agarens inbäddning teknik, orientera larverna under den korta tid innan Agarens stelnar5,6,7. Snabbt att manipulera larven förutsätter inte bara skicklighet av användaren, det riskerar också att skada larven. Även om metoder att stabilisera larven för levande imaging har beskrivits för att kringgå dessa nackdelar, såsom räfflad agar brunnar3 eller divets8, användning av silikon vakuum fett för att skapa en avbildning kammare med PVC-rör eller andra material6och roterande slang9, många av dessa metoder är labor intensiv, stökigt, ofta icke-återanvändningsbara och tillåter inte för miljömässiga manipulation (drug behandlingar, såra osv.) efter fisken har monterats.
Därför utformades zWEDGI enheten (figur 1) för att övervinna några av nackdelarna med agar montering för långsiktiga levande avbildning av zebrafisk larver medan tillåter manipulering av preparatet. ZWEDGI består av tre halvöppna konkurrensbetingat kammare (figur 1A) för att möjliggöra för lastning, återhållsamhet, såra och avbildning av 2 till 4 dagar efter befruktning zebrafiskar larver. Enheten är fabricerade från Polydimetylsiloxan (PDMS) och placeras på täckglaset av en 60 mm glas botten imaging maträtt. Designen presenteras här var avsedd för såret helande studier, men användningen av en modulär design och standard fabrication teknik gör den zWEDGI designen kan ändras och kan bli föremål för en mängd olika experimentella rutiner, särskilt för förfaranden som kräver minimal återhållsamhet med experimentella manipulation och långsiktiga imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med zWEDGI enheten är att fånga 3D tidsfördröjning imaging av stabiliserande och inrikta fisken inom små arbetsavstånd ett högupplöst Mikroskop mål. Samtidigt som den uppfyller dessa specifikationer för konstruktionen, är det också en förbättring över traditionella agar-baserade förberedelse för levande imaging. Det finns tre kritiska steg (nedan) vid tillverkning av den zWEDGI, som, om inte gjort rätt, kan resultera i skadade enheter:
PDMS förberedelse (<strong class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna primära projektfinansiering från Morgridge Institutet för forskning och laboratoriet för optisk och Computational instrumentering. Vi erkänner också finansiering från NIH # R01GM102924 (AH och KWE). KH, JMS, RS, AH och KWE utformades och utformat studien. KH och JMS utförs alla experiment med stöd från DL, KP och RS. KH, JS, RS, AH och KWE bidragit till handstilen av manuskriptet.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
