À long terme direct Imaging Device pour meilleure Manipulation expérimentale des larves de poisson zèbre
Summary
Ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui est un dispositif compartimenté destiné à orienter et à empêcher les larves de poisson zèbre. La conception permet la transection de la queue et à long terme collection d’images de microscopie de fluorescence à haute résolution de la cicatrisation et de régénération.
Abstract
La larve de poisson-zèbre est un organisme modèle important pour la biologie du développement et de la cicatrisation des plaies. Par ailleurs, la larve de poisson-zèbre est un système utile pour l’imagerie microscopique direct haute résolution des phénomènes biologiques dynamiques dans l’espace et le temps avec résolution cellulaire. Toutefois, la méthode traditionnelle d’encapsulation d’agarose pour l’imagerie live peut entraver le développement larvaire et repousse des tissus. Par conséquent, ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui a été conçu et fabriqué comme un dispositif fonctionnellement compartimenté pour orienter les larves pour la microscopie à haute résolution tout en permettant transection de nageoire caudale au sein de l’appareil et le développement subséquent de queue sans retenue et le repousse. Ce dispositif permet de blesser et de l’imagerie à long terme tout en préservant la viabilité. Étant donné que le moule de zWEDGI est imprimé en 3D, les possibilités de personnalisation de ses géométries rendent facilement modifiables pour applications diverses poisson-zèbre. En outre, le zWEDGI offre de que nombreux avantages, tels que l’accès à la larve au cours de l’expérimentation pour blessure ou pour l’application de réactifs, parallèlement à l’orientation des larves multiples pour l’imagerie simplifiée et réutilisabilité de l’appareil.
Introduction
La capacité de régénération des larves de poisson zèbre Danio rerio rendent un organisme modèle idéal pour examiner la réponse de la plaie ainsi que guérison et repousse1,2,3,4. Accès à un tableau de lignées transgéniques de poisson-zèbre et transparence d’anatomique du poisson-zèbre encore améliorer leur utilité pour les études in vivo de plaie réponse événements ainsi qu’à plus long terme du processus de régénération4. Étude de ces processus biologiques à l’aide de la microscopie en fluorescence Time-lapse haute résolution donc exige un appareil d’imagerie live de poisson-zèbre qui permet une stabilité élevée et mouvement minimal de la larve de poisson-zèbre tout en préservant la viabilité. Il est essentiel que l’appareil permette blessant efficace tout en la guérison et la régénération se produisent pas affecté par le dispositif.
La méthode de stabilisation standard d’imagerie direct d’incorporation de la larve dans l’agarose en imagerie live limite la croissance et enroulé de régénération5 et peut augmenter les taux de mortalité étant donné que les larves commencent à montrer des signes de nécrose cardiaque de stress et de tissus après quatre heures4. Par conséquent, la suppression d’agarose de régions d’intérêt est souvent nécessaire pour permettre le développement normal et régénération6, exposer les larves à des dégâts potentiels que l’agarose est coupé. En outre, avec l’agarose, intégration technique, l’utilisateur doit orienter les larves dans le peu de temps avant l’agarose solidifie5,6,7. Rapidement, manipulant la larve requiert non seulement des compétences de l’utilisateur, elle risque aussi de dommages à la larve. Méthodes pour stabiliser la larve d’imagerie live ont été décrits pour contourner ces inconvénients, comme la gélose striée puits3 ou divets8, à l’utilisation du vide de silicone graisse pour créer une chambre d’imagerie avec la tuyauterie de PVC ou autre matériaux6et rotation tubes9, beaucoup de ces méthodes sont du travail intensif, malpropre, souvent non réutilisables et ne permettent pas de manipulation environnementale (pharmacothérapie, blessant etc..) après que le poisson a été monté.
Par conséquent, le dispositif de zWEDGI (Figure 1) a été conçu pour surmonter certains des inconvénients de la gélose de montage pour l’imagerie live à long terme des larves de poisson zèbre tout en permettant la manipulation de l’échantillon. Le zWEDGI est composé de trois chambres compartimentées semi-ouvert (Figure 1 a) pour permettre de chargement, retenue, le blessant et l’imagerie des larves de poisson zèbre après fécondation de 2 à 4 jours. Le dispositif est fabriqué de polydiméthylsiloxane (PDMS) et placé sur la lamelle couvre-objet d’un plat d’imagerie de fond verre 60 mm. La conception présentée ici a été destinée aux études guérison de plaie, cependant l’utilisation d’une conception modulaire et les technologies de fabrication standard font la conception zWEDGI modifiable et se prêtent à une variété de procédures expérimentales, en particulier pour les procédures qui exiger une retenue minimale avec manipulation expérimentale et l’imagerie à long terme.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de l’appareil zWEDGI est de capturer le laps de temps 3D imaging en stabilisant et en orientant le poisson au sein de la petite distance de travail d’un objectif de microscope de haute résolution. Tout en répondant à ces spécifications de conception, c’est aussi une amélioration au cours de la préparation traditionnelle axée sur la gélose, imagerie live. Il y a trois étapes critiques (ci-dessous) dans la fabrication de la zWEDGI, qui, si ne pas fait correctement, peut entraîner des dispositif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait remercier financement de projets primaire de l’Institut Morgridge pour la recherche et le laboratoire d’optique et d’Instrumentation computationnelle. Nous remercions également le financement de NIH # R01GM102924 (AH et KWE). KH, JMS, RS, AH et KWE conçu et destiné à l’étude. KH et JMS exécuté toutes les expériences avec l’appui du DL, KP et RS. KH, JS, RS, AH et KWE a contribué à la rédaction du manuscrit.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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