התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה
Summary
כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר הוא מכשיר ממודר שנועדה אוריינט לרסן את הזחלים דג זברה. העיצוב מאפשרת חיתוך זנב ארוך טווח אוסף של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של ריפוי הפצע והתחדשות.
Abstract
הזחל דג זברה היא אורגניזם מודל חשוב ביולוגיה התפתחותית וגם ריפוי הפצע. עוד יותר, הזחל דג זברה היא מערכת חיה דימות ברזולוציה מיקרוסקופיים התופעות ביולוגית דינאמית במרחב ובזמן עם רזולוציה הסלולר יקר. עם זאת, השיטה המסורתית של כימוס agarose עבור הדמיה חיה לטרפד פיתוח זחל, רקמות לצמיחה מחודשת. לכן, כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר היה מיועד, מפוברק כהתקן פונקציונלית ממודר כדי להציב את הזחלים של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בזמן המתיר סנפיר סימטרית חיתוך בתוך המכשיר, הזנב ערככם עוקבות התפתחות וצמיחה re. התקן זה מאפשר ופצעו והדמיה לטווח ארוך תוך שמירה על יכולת הקיום. בהתחשב בכך כייר zWEDGI הוא 3D מודפס, ביכולת ההתאמה האישית של גיאומטריות שלה לעשות את זה בקלות שונה עבור יישומי הדמיה דג זברה מגוונות. יתר על כן, zWEDGI מציע שיתרונות רבים, כגון גישה הזחל במהלך ניסויים עבור ופצעו או היישום של ריאגנטים, הוקרב הכיוון של הזחלים מרובים עבור הדמיה יעיל, שימושית של המכשיר.
Introduction
יכולת ההתחדשות של דג זברה הזחלים רזבורה rerio להפוך אותם אורגניזם מודל אידיאלי בחינת הפצע התגובה, כמו גם לריפוי, לצמיחה מחודשת1,2,3,4. גישה למערך של דג זברה מהונדס קווים ושקיפות של דג זברה אנטומיים נוספים לשפר את השירות שלהם ללימודי אין ויוו של הפצע התגובה לאירועים, כמו גם לתהליכי הרגנרציה וקהילותיהם4. חקר תהליכים ביולוגיים אלה באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה זריחה זמן לשגות ולכן תובע חיה הדמיה דג זברה התקן המאפשר תנועה מינימלית של הזחל דג זברה והיציבות גבוהה תוך שמירה על יכולת הקיום. . זה המפתח כי המכשיר מאפשר ופצעו יעיל בעת ריפוי, התחדשות להתרחש לא מושפע על ידי המכשיר
חיה הדמיה מייצב השיטה הרגילה הטבעה הזחל ב- agarose במהלך דימות בשידור חי מגבילה את הצמיחה, פצע התחדשות5 , עשוי להגדיל את שיעורי התמותה מאז מתחילים הזחלים להראות סימן לב לב מתח, רקמת נמק אחרי 4 שעות4. לכן, הסרת agarose מאזורים עניין לעתים קרובות יש צורך לאפשר להתפתחות התקינה, התחדשות6, לחשוף את הזחלים נזק פוטנציאלי כמו agarose זה לחתוך. יתר על כן, עם agarose טכניקת הטבעה, המשתמש חייב אוריינט הזחלים בזמן הקצר לפני agarose עפור5,6,7. במהירות מניפולציה הזחל לא רק דורש מיומנות של המשתמש, גם סיכון לפגיעה הזחל. למרות שיטות לייצב את הזחל עבור הדמיה חיה תוארו לעקוף חסרונות אלה, כמו אגר מחורץ בארות3 או divets8, שימוש סיליקון בוואקום משמנים ליצירת תא הדמיה עם צנרת PVC או אחרים חומרים6וסבב אבובים9, מרבית השיטות האלה הם עבודה אינטנסיבית, מבולגן, לעיתים קרובות ללא הניתן וגם לא מאפשרים מניפולציות סביבתיות (תרופות טיפולים, ופצעו וכו.) אחרי הדגים יש לטעון.
לכן, המכשיר zWEDGI (איור 1) תוכנן כדי להתגבר על חלק החסרונות של אגר הרכבה עבור הדמיה חיים לטווח ארוך של דג זברה הזחלים בזמן המתיר מניפולציה של הדגימה. ZWEDGI מורכב שלוש פתוח למחצה ממודר צ’יימברס (איור 1 א’) כדי לאפשר טעינה, איפוק, ופצעו, הדמיה של 2-4 ימים לאחר ההפריה דג זברה הזחלים. המכשיר מפוברק מן Polydimethylsiloxane (PDMS), להציב על גבי בתגית כיסוי זכוכית 60 מ מ בתחתית צלחתי הדמיה. העיצוב המובאת כאן נועד ללימודי ריפוי הפצע, אולם השימוש העיצוב המודולרי וטכנולוגיות ייצור רגיל לעשות עיצוב zWEDGI לשינוי, נוטה מגוון פרוצדורות ניסיוני, במיוחד עבור שגרות זה מחייבים ריסון מינימלי עם מניפולציה ניסויית והדמיה לטווח ארוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של המכשיר zWEDGI הוא לכידת תלת-ממד זמן לשגות הדמיה על ידי ייצוב המכוונת את הדגים בתוך המרחק עבודה קטן של מטרה מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. תוך עמידה מפרטים אלה עיצוב, זה גם שיפור מעל המסורתית מבוססת אגר הכנה עבור הדמיה בשידור חי. ישנם שלושה שלבים קריטיים (להלן) בייצור של zWEDGI, אשר, אם לא נעשה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר הפרוייקט העיקרי למימון ממכון Morgridge המעבדה ומחקר עבור אופטיות ומכשור חישובית. אנו גם להכיר מימון NIH # R01GM102924 (AH ו- KWE). ח’, JMS, ר’, AH, KWE נוצר ועוצב על המחקר. ח’, JMS ביצע ניסויים כל עם תמיכה DL, KP, ר’. ח’, JS, ר’, AH KWE תרמו הכתיבה של כתב היד.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
