Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치
Summary
이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.
Abstract
Zebrafish 애벌레 발달 생물학 및 상처 치유에 대 한 중요 한 모형 유기 체 이다. 또한, zebrafish 애벌레 셀룰러 해상도 시간과 공간에 동적 생물 현상의 라이브 고해상도 현미경 이미징에 대 한 중요 한 시스템 이다. 그러나, 애벌레의 개발 및 조직 regrowth 라이브 이미징 agarose 캡슐화의 전통적인 방법 방해 수 있습니다. 따라서,이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치),이 설계 하 고 허용 하는 동안 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 애벌레 하 기능 compartmentalized 장치 조작 꼬리 지 느 러 미 transection 장치 및 후속 억제 꼬리 개발 시간과 다시 성장. 이 장치는 부상 및 생존 능력을 유지 하면서 장기적인 이미징에 대 한 수 있습니다. ZWEDGI 형 3D 인쇄는, 그 형상의 customizability 하기가 쉽게 다양 한 zebrafish 이미징 응용 프로그램에 대 한 수정. 또한,는 zWEDGI 실험 동안 유 충에 부상 또는 시 약의 응용 프로그램에 대 한 액세스와 같은 다양 한 혜택 paralleled 유선형된 이미징에 대 한 여러 애벌레의 방향 및 장치의 재사용성을 제공 합니다.
Introduction
Zebrafish 애벌레 Danio rerio 의 재생 용량 그들에 대 한 응답 상처 치유와 자라나1,2,,34검토 이상적인 모델 유기 체를 확인 합니다. 유전자 변형 zebrafish 라인과 zebrafish의 해부학 투명도 추가의 배열에 대 한 액세스 향상 장기 재생 프로세스4상처 응답 이벤트의 vivo에서 학문에 대 한 그들의 유틸리티. 따라서 고해상도 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이러한 생물 학적 과정의 연구는 생존 능력을 유지 하면서 높은 안정성과 제 브라 유 충의 최소한의 움직임을 허용 하는 라이브 이미징 zebrafish 장치를 요구 한다. 그것은 키 장치 허용 효과적인 부상 치유 하는 동안 재생 발생 장치에 의해 영향을 받지 않습니다.
라이브 영상 중 agarose에서 유 충을 포함의 표준 라이브 영상 안정화 방법 성장 제한 및 재생5 상처와 애벌레 4 후 심장 스트레스와 조직 괴 사의 기호를 표시 하기 시작 이후 사망률을 증가 시킬 수 있습니다. 시간4. 따라서, 관심 영역에서 agarose의 제거는 종종 정상적인 개발을 허용 하는 데 필요한 및 재생6, 애벌레는 agarose로 잠재적인 손상에 노출 버려야. 또한, 기술을 포함 하는 agarose와 사용자 해야 합니다 동양 짧은 시간에 애벌레는 agarose5,,67고형화 하기 전에. 신속 하 게 사용자의 요구 뿐만 아니라 유 충을 조작, 그것은 또한 유 충에 손상을 위험. 라이브 영상에 대 한 유 충을 안정화 하는 방법 등이 천 우물3 또는 divets8, 등 이러한 단점을 우회 하 설명 되었습니다 있지만 실리콘 진공의 사용 PVC 파이프 또는 기타 이미징 챔버를 만드는 그리스 자료6, 그리고 회전 튜브9를 이러한 방법의 많은 집중, 더러 워, 자주 재사용 노동 환경 조작에 대 한 허용 하지 않습니다 (약물 치료, 부상 등.) 물고기를 탑재.
따라서, zWEDGI 장치 (그림 1) 일부는 시료의 조작을 허용 하는 동안 zebrafish 애벌레의 장기 라이브 이미징 장착 한의 단점을 극복 하기 위해 설계 되었습니다. 로드, 구속, 부상 및 2 ~ 4 일 후 수정 zebrafish 애벌레의 이미징에 대 한 세 반 오픈 compartmentalized 챔버 (그림 1A) 허용 하는 zWEDGI에 의하여 이루어져 있었다. 장치입니다 (PDMS)에서 조작 이며 60 m m 유리 하단 이미징 접시의 커버 슬립에 배치. 그러나 여기에 제시 했다 위한 상처 치유 연구, 모듈형 설계 및 표준 제조 기술을 사용 하 여 만들 zWEDGI 디자인 수정 가능 하 고 다양 한 실험 절차, 특히 절차에 대 한 의무가 있는 실험적인 조작 및 장기적인 이미지와 최소한의 자제를 요구 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZWEDGI 장치의 목적은 안정화와 고해상도 현미경 목표의 작은 작업 거리 물고기 방향을 이미징 3D 시간 경과 잡으려고. 이러한 설계 사양을 충족 하는 동안 그것은 또한 개선 라이브 이미징에 대 한 전통적인 천 기반 준비 에입니다. 제대로 하지 발생할 수 있습니다 결함이 있는 장치는, zWEDGI의 제작에는 3 개의 중요 한 단계 (아래 참조) 있습니다.
PDMS 준비 (그림 5A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 기본 프로젝트 자금 광학 및 전산 장비에 대 한 연구 및 실험실을 위한 Morgridge 학회에서 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 NIH # R01GM102924에서 자금 인정 (아와 KWE). KH, JMS, RS, 아 KWE 잉태와 설계 연구. KH와 JMS DL, KP와 RS에서 지 원하는 모든 실험을 수행. KH, JS, RS, 아와 KWE 원고 쓰기에 공헌 했다.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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