Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı
Summary
Bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve büyüme ve görüntüleme için tuzak aygıt), şark ve Zebra balığı larva dizginlemek için tasarlanmış bir compartmentalized alet olduğu. Tasarım kuyruk transeksiyon ve yara iyileşmesi ve rejenerasyon yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi görüntüleri uzun vadeli koleksiyonu izin verir.
Abstract
Zebra balığı larva bir gelişim biyolojisi ve yara iyileşmesi için önemli model organizmadır. Ayrıca, Zebra balığı larva uzay ve zaman ile hücresel kararlılık içinde dinamik biyolojik olayların canlı yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntüleme için değerli bir sistemdir. Ancak, özel saklama geleneksel yöntem canlı görüntüleme için larva geliştirme ve doku büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve tuzak aygıt büyüme ve görüntüleme için), hangi tasarlanmış ve larva yüksek çözünürlüklü mikroskopi için izin ederken yönlendirmek için işlevsel olarak bölümlere bir aygıt olarak fabrikasyon Kaudal fin transeksiyon aygıt ve sonraki kontrolsüz kuyruk geliştirme ve yeniden büyüme içinde. Yaralama ve canlılığı koruyarak uzun vadeli görüntüleme için bu cihaz sağlar. ZWEDGI kalıp baskılı 3D olduğunu göz önüne alındığında, onun geometrileri customizability üstesinden kolaylıkla değiştirilerek farklı Zebra balığı görüntüleme uygulamaları için. Ayrıca, zWEDGI kolay görüntüleme için birden çok larvalar yönünü ve aygıtı yeniden kullanılırlığı reaktifler, uygulanması veya yaralama için deneme sırasında larva erişim gibi çok sayıda avantaj paralellik sunar.
Introduction
Zebra balığı larva Danio rerio yeniden üretim kapasitesini yapmak onları bir ideal model organizma yara yanıt yanı sıra1,2,3,4şifa ve büyütme incelenmesi. Transgenik Zebra balığı hatları ve Zebra balığı’nın anatomik şeffaflık daha fazla bir dizi erişim için in vivo çalışmalar yara yanıt olaylar hem de uzun vadeli rejeneratif işlemleri4onların yardımcı geliştirmek. Bu nedenle yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış Floresans mikroskobu kullanarak bu biyolojik süreçlerin çalışma yüksek kararlılık ve Zebra balığı larva en az hareketin canlılığı koruyarak sağlar canlı bir görüntü Zebra balığı aygıtı gerektirir. Bu cihazın etkili şifa süre yaralama için izin verir ve rejenerasyon oluşur aygıt tarafından etkilenmemiş anahtarıdır.
Larva özel içinde canlı görüntüleme sırasında katıştırma Standart canlı görüntüleme sabitleme yöntemi büyüme kısıtlar ve rejenerasyon5 yara ve larva dört sonra kalp stres ve doku nekrozu belirtisi göstermeye başlar beri ölüm oranlarını artırabilir Saat4. Bu nedenle, özel ilgi bölgelerinden kaldırılması genellikle normal gelişim izin gereklidir ve rejenerasyon6için özel olarak potansiyel zararı larvalar açığa, kes gitsin. Ayrıca, özel5,6,7katılaşır önce teknik katıştırma özel ile kısa sürede larva kullanıcı yönlendirmek gerekir. Hızla larva manipüle sadece kullanıcının beceri gerektirir, ayrıca larva hasar riski. Her ne kadar canlı görüntüleme için larva stabilize etmek için yöntemler ridged agar wells3 veya divets8gibi bu sakıncaları aşmak için tarif var silikon vakum kullanımı yağ PVC boru veya diğer görüntüleme bir oda oluşturmak için malzemeler6ve dönme tüp9, bu yöntemlerin çoğu vardır emek yoğun, dağınık, sık sık yeniden ve çevre düzenlemesi için izin verme (ilaç tedavileri, yaralama vb.) Balık takıldıktan sonra.
Bu nedenle, zWEDGI cihazı (Resim 1) bazı örnek manipülasyon erişimine izin verme sırasında Zebra balığı larvalar uzun vadeli canlı görüntüleme için montaj agar sakıncaları üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. ZWEDGI üç yarı açık bölümlere odaları (izin vermek için,şekil 1A) yükleme, kısıtlama, yaralama ve 2-4 gün sonrası döllenme Zebra balığı larva görüntüleme için oluşur. Cihaz Polydimethylsiloxane (PDMS) imal edilmiştir ve kapak notu bir 60 mm cam alt görüntüleme tabak yerleştirilir. Ancak zWEDGI tasarım modüler tasarım ve standart üretim teknolojileri kullanmanıza değiştirilebilir ve yordamlar için özellikle deneysel prosedürler çeşitli mükellef burada sunulan tasarım yara iyileştirici çalışmalar için amaçlanan oldu bu deneysel manipülasyon ve uzun vadeli görüntüleme ile en az kısıtlama gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D zaman atlamalı istikrarı ve yüksek çözünürlüklü mikroskop objektif küçük çalışma uzaklığı içindeki balık yönlendirme tarafından görüntüleme yakalamak için zWEDGI cihazın amacı budur. Bu tasarım özellikleri karşılarken, aynı zamanda bir gelişme canlı görüntüleme için geleneksel agar tabanlı hazırlık bitti. Hangi doğru yapılmazsa arızalı aygıtlar neden olabilir zWEDGI imalatı (aşağıda) üç kritik adım vardır:
PDMS hazırlık (<strong class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar birincil proje Morgridge Enstitüsü’nden araştırma laboratuvarı için görme duyusuyla ilgili ve hesaplama araçları için finansman ve kabul etmek istiyorum. NIH # R01GM102924 finansman anıyoruz (AH ve KWE). KH, JMS, RS, AH ve KWE gebe ve çalışma tasarlanmış. KH ve JMS desteği ile tüm deneylerin DL, KP ve RS yapılır. KH, JS, RS, AH ve KWE el yazması yazmaya katkıda bulunmuştur.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
