Denne protokollen effektivt studier pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser ved å integrere synkronisering av cellen divisjon, overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi og kvantitativ tenkelig analyse.
Studiet av hvordan pattedyr celledeling er regulert i en 3D miljø forblir stort sett uutforsket tross sin fysiologiske relevans og terapeutiske betydning. Mulige årsaker til mangel på leting er eksperimentell begrensninger og tekniske utfordringer som gjengir studiet av cellen divisjon i 3D kultur ineffektiv. Her beskriver vi en imaging-basert metode for å effektivt studere pattedyr celledeling og celle-matrix samhandlinger i 3D kollagen matriser. Celler merket med fluorescerende H2B synkroniseres med kombinasjonen av thymidine blokkerer og nocodazole behandling, etterfulgt av en mekanisk riste av teknikk. Synkroniserte celler er innebygd i en 3D kollagen matrise. Celledeling overvåkes ved hjelp av live-celle mikroskopi. Deformasjon av kollagen fibrene under og etter celledeling, som er en indikator på cellen matrise samhandling, kan overvåkes og kvantifisert ved hjelp av kvantitative AC confocal refleksjon mikroskopi. Metoden gir en effektiv og generell tilnærming for å studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaksjoner i en fysiologisk relevante 3D-miljø. Denne tilnærmingen ikke bare gir ny innsikt i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer, men gir også mulighet for utformingen av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.
Cellen mitose er en kritisk hendelse i mobilnettet liv, regulering av som spiller avgjørende roller i vev og organ utvikling. Unormal mitose er innblandet i naturlig genetisk variasjoner, menneskelige aldring prosesser og progresjon av kreft,1,,2,,3,,4,,5. Økt er spredning av kreftceller sammenlignet med normale celler ett av kjennetegnene av kreft, tross at cellen atferd er ganske heterogene blant annet typer av svulst og selv blant pasienter. Til tross for lovende prekliniske resultater vist noen nyutviklet antimitotic stoffer ikke seg for å være effektive i kliniske studier6,7,8,9,10 ,11. Relevansen av eksperimentelle og prekliniske modeller har vurderes. Mange typer normale pattedyr og kreft celler dele i tredimensjonale (3D) matriser, som fibroblaster og fibrosarcoma celler i kollagen-rike 3D bindevev og metastatisk kreftceller i 3D stromal ekstracellulær matrix (EFM). Imidlertid er det store flertallet av pattedyr celledeling eksperimenter og analyser utført på celler kultivert på todimensjonale (2D) underlag. En konstruert 3D matrise kan bedre recapitulate mikrostruktur, mekaniske egenskaper og biokjemiske signaler av 3D ECM både normal og patologisk vev12,13,14, 15,16,17.
Studiet av hvordan pattedyr celledeling er regulert i 3D miljøer forblir stort sett uutforsket til tross for både fysiologiske relevansen og terapeutiske betydning18,19. Mulige årsaker inkluderer tekniske problemer og eksperimentelle utfordringer knyttet studere celledeling i 3D matriser. Cellen mitose utgjør en timelig brøkdel i hele cellen syklus20. Tidligere arbeid har vist at spredning frekvensen av mange pattedyrceller, som menneskelig bryst adenocarcinoma MCF-7, menneskelige osteosarcoma U2OS og menneskelige lever HepG2, er mye lavere i 3D matriser sammenlignet med sine kolleger på 2D underlag21, 22. Videre flytte celler i 3D matriser av fokus under live-celle bildebehandling. Alle disse faktorene bidra til ekstremt lav effektivitet av fange celledeling hendelser i 3D kultur med imaging teknikker.
Interaksjoner mellom de ECM og spille viktige roller i å regulere celledelinger. Her beskriver vi tilnærming for å effektivt studere pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser. Metoden inneholder inkorporering av mitotisk indikatorer som cellene, synkronisering av cellen divisjon, samt overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi, og kvantitativ tenkelig analyse. Fluorescens-merket histone protein H2B er først introdusert i cellene som en markør å skille mitotisk og interphase celler. Deretter synkroniseres cellene med kombinasjonen av thymidine blokkerer og nocodazole behandling, etterfulgt av en mekanisk riste av teknikk. Synkroniserte celler er deretter direkte innkapslet i 3D kollagen matriser. Celledeling hendelsene i flere celler, overvåkes effektivt med lav forstørrelse time-lapse live-celle imaging. Deformasjon av kollagen fibrene, som er en indikator på cellen matrise samhandling, overvåkes med AC confocal refleksjon mikroskopi på høy forstørrelse.
Vi har brukt denne teknikken til å overvåke og kvantifisere celle matrise samhandling før, under og etter mitose to metastatisk kreftcelle linjer, menneskelige invasiv ductal karsinom MDA-MB-231 og menneskelig fibrosarcoma HT1080 celler, i 3D kollagen matriser19. Metodene presenteres her gi en effektiv og generell tilnærming for å studere både pattedyr celledeling i et 3D-miljø og celle-matrise interaksjoner. MDA-MB-231 celle linjen brukes som et eksempel gjennom papiret. Denne protokollen gir ny innsikt i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer, og kan også tillate for design av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.
Den tidligere studien av cellen divisjon i 3D var ikke effektiv eksperimentelle begrensninger og tekniske utfordringer18,19. Kritisk trinnene for effektiv av pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser er: (1) inkorporering av fluorescens-merket mitotisk indikatorer som cellene, (2) synkroniseringen av cellen divisjon; og (3) overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi og kvantitative tenkelig …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH gir R01CA174388 og U54CA143868. Forfatterne ønsker å erkjenne PURA prisen fra Johns Hopkins University for støtte av Wei-tong Chen. Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation Graduate forskning fellesskap under Grant nr. 1232825.
Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Fugene HD | Promega | E2311 | |
Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
Collagen | Corning | 354236 | |
NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |