JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생체공학

Pattedyr celledeling i 3D matriser via kvantitative AC Confocal refleksjon mikroskopi

Published: November 29, 2017
doi:
10.3791/56364
, , , , , , ,
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Johns Hopkins University, 2Johns Hopkins Physical Sciences – Oncology Center,Johns Hopkins University, 3Department of Biomedical Engineering,Johns Hopkins University, 4Departments of Oncology and Pathology and Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Denne protokollen effektivt studier pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser ved å integrere synkronisering av cellen divisjon, overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi og kvantitativ tenkelig analyse.

Abstract

Studiet av hvordan pattedyr celledeling er regulert i en 3D miljø forblir stort sett uutforsket tross sin fysiologiske relevans og terapeutiske betydning. Mulige årsaker til mangel på leting er eksperimentell begrensninger og tekniske utfordringer som gjengir studiet av cellen divisjon i 3D kultur ineffektiv. Her beskriver vi en imaging-basert metode for å effektivt studere pattedyr celledeling og celle-matrix samhandlinger i 3D kollagen matriser. Celler merket med fluorescerende H2B synkroniseres med kombinasjonen av thymidine blokkerer og nocodazole behandling, etterfulgt av en mekanisk riste av teknikk. Synkroniserte celler er innebygd i en 3D kollagen matrise. Celledeling overvåkes ved hjelp av live-celle mikroskopi. Deformasjon av kollagen fibrene under og etter celledeling, som er en indikator på cellen matrise samhandling, kan overvåkes og kvantifisert ved hjelp av kvantitative AC confocal refleksjon mikroskopi. Metoden gir en effektiv og generell tilnærming for å studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaksjoner i en fysiologisk relevante 3D-miljø. Denne tilnærmingen ikke bare gir ny innsikt i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer, men gir også mulighet for utformingen av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.

Introduction

Cellen mitose er en kritisk hendelse i mobilnettet liv, regulering av som spiller avgjørende roller i vev og organ utvikling. Unormal mitose er innblandet i naturlig genetisk variasjoner, menneskelige aldring prosesser og progresjon av kreft,1,,2,,3,,4,,5. Økt er spredning av kreftceller sammenlignet med normale celler ett av kjennetegnene av kreft, tross at cellen atferd er ganske heterogene blant annet typer av svulst og selv blant pasienter. Til tross for lovende prekliniske resultater vist noen nyutviklet antimitotic stoffer ikke seg for å være effektive i kliniske studier6,7,8,9,10 ,11. Relevansen av eksperimentelle og prekliniske modeller har vurderes. Mange typer normale pattedyr og kreft celler dele i tredimensjonale (3D) matriser, som fibroblaster og fibrosarcoma celler i kollagen-rike 3D bindevev og metastatisk kreftceller i 3D stromal ekstracellulær matrix (EFM). Imidlertid er det store flertallet av pattedyr celledeling eksperimenter og analyser utført på celler kultivert på todimensjonale (2D) underlag. En konstruert 3D matrise kan bedre recapitulate mikrostruktur, mekaniske egenskaper og biokjemiske signaler av 3D ECM både normal og patologisk vev12,13,14, 15,16,17.

Studiet av hvordan pattedyr celledeling er regulert i 3D miljøer forblir stort sett uutforsket til tross for både fysiologiske relevansen og terapeutiske betydning18,19. Mulige årsaker inkluderer tekniske problemer og eksperimentelle utfordringer knyttet studere celledeling i 3D matriser. Cellen mitose utgjør en timelig brøkdel i hele cellen syklus20. Tidligere arbeid har vist at spredning frekvensen av mange pattedyrceller, som menneskelig bryst adenocarcinoma MCF-7, menneskelige osteosarcoma U2OS og menneskelige lever HepG2, er mye lavere i 3D matriser sammenlignet med sine kolleger på 2D underlag21, 22. Videre flytte celler i 3D matriser av fokus under live-celle bildebehandling. Alle disse faktorene bidra til ekstremt lav effektivitet av fange celledeling hendelser i 3D kultur med imaging teknikker.

Interaksjoner mellom de ECM og spille viktige roller i å regulere celledelinger. Her beskriver vi tilnærming for å effektivt studere pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser. Metoden inneholder inkorporering av mitotisk indikatorer som cellene, synkronisering av cellen divisjon, samt overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi, og kvantitativ tenkelig analyse. Fluorescens-merket histone protein H2B er først introdusert i cellene som en markør å skille mitotisk og interphase celler. Deretter synkroniseres cellene med kombinasjonen av thymidine blokkerer og nocodazole behandling, etterfulgt av en mekanisk riste av teknikk. Synkroniserte celler er deretter direkte innkapslet i 3D kollagen matriser. Celledeling hendelsene i flere celler, overvåkes effektivt med lav forstørrelse time-lapse live-celle imaging. Deformasjon av kollagen fibrene, som er en indikator på cellen matrise samhandling, overvåkes med AC confocal refleksjon mikroskopi på høy forstørrelse.

Vi har brukt denne teknikken til å overvåke og kvantifisere celle matrise samhandling før, under og etter mitose to metastatisk kreftcelle linjer, menneskelige invasiv ductal karsinom MDA-MB-231 og menneskelig fibrosarcoma HT1080 celler, i 3D kollagen matriser19. Metodene presenteres her gi en effektiv og generell tilnærming for å studere både pattedyr celledeling i et 3D-miljø og celle-matrise interaksjoner. MDA-MB-231 celle linjen brukes som et eksempel gjennom papiret. Denne protokollen gir ny innsikt i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer, og kan også tillate for design av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.

Protocol

Protokollen gitt følger retningslinjene av The Homewood institusjonelle Review Board (HIRB). 1. stabil uttrykk for H2B-mCherry som en markør for cellen mitose Generasjon av lentiviral partikler fra menneskelige embryonale nyre 293T (HEK 293T) celler Plate HEK 293T cellene i en 10 cm celle kultur parabol på tettheten av 5 x 106 celler/parabolen i celle kultur medium (Dulbeccos endret Eagle’s Medium (DMEM) inneholder høy glukose (4.5 g/L), nat…

Representative Results

Målet med denne artikkelen er å presentere en imaging-basert metode å studere pattedyr celledeling prosesser i 3D matriser og kvantifisere samspillet mellom cellen og 3D ekstracellulær matrix under og etter celledeling. For å lette avbilding av cellen mitose, innlemmet vi H2B-mCherry i MDA-MB-231 celler med lentiviral signaltransduksjon. H2B konjugert med fluorescerende proteiner er brukt som en mitotisk markør skille mitotisk celler fra interphase celler og definere ulike faser i c…

Discussion

Den tidligere studien av cellen divisjon i 3D var ikke effektiv eksperimentelle begrensninger og tekniske utfordringer18,19. Kritisk trinnene for effektiv av pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser er: (1) inkorporering av fluorescens-merket mitotisk indikatorer som cellene, (2) synkroniseringen av cellen divisjon; og (3) overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi og kvantitative tenkelig …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av NIH gir R01CA174388 og U54CA143868. Forfatterne ønsker å erkjenne PURA prisen fra Johns Hopkins University for støtte av Wei-tong Chen. Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation Graduate forskning fellesskap under Grant nr. 1232825.

Materials

Human embryonic kidney 293T ATCC
MDA-MB-231 Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM powder ThermoFisher Scientific 12100-046
Fetal bovine serum Hyclone SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X Sigma-Aldrich P0781
Fugene HD Promega E2311
Lipofectamine 2000 Life technologies 11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector Addgene plasmid 21217
Thymidine Sigma-Aldrich T1895
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Sodium bicarbonate GibcoBRL 11810-025
HEPES Sigma-Aldrich 113375-100
Collagen Corning 354236
NaOH J.T. Bake 3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm Millipore SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope Nikon TE2000E
Cascade 1K CCD camera Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software Nikon
Nikon A1 confocal microscope Nikon A1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
  4. Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
  5. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  6. Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
  7. Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
  8. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
  9. Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
  10. Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
  11. Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
  12. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
  13. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  14. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  15. Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
  16. Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
  17. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  18. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
  19. He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
  20. Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
  21. Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
  22. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  23. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
  24. Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
  25. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
  26. Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
  27. Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
  28. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  29. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
  30. Jackman, J., O’Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
  31. Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
  32. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
  33. Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
  34. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
  35. Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
  36. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
  37. Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
  38. Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
  39. Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
  40. Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).

Tags

3D MatricesMammalian Cell DivisionConfocal Reflection MicroscopyHEK-293 T-cellsLentiviral VectorTransfectionMDA-MB-231 CellsCell CultureCell Matrix InteractionsCell Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
He, L., Sneider, A., Chen, W., Karl, M., Prasath, V., Wu, P., Mattson, G., Wirtz, D. Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56364, doi:10.3791/56364 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image