架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号
Summary
このプロトコルでは、第二高調波発生のイメージングおよび示差走査熱量測定を使用してウサギの強膜の化学架橋を評価するための手法について説明します。
Abstract
光化学架橋と組織 (TXL) メソッドを架橋構造蛋白質 (フィブリル型コラーゲン) 療法のために (非酵素的架橋) の化学結合を導入して組織を強化するためのメソッドが含まれます。機械的組織プロパティの変更を誘導するためこのような方法採用されている角膜に進歩的な近視で強膜と同様、円錐角膜などの角膜を薄く (機械的に弱体化) 障害の間伐と後部の弱体化強膜が発生し、体軸の伸長に寄与します。このような組織を強化するための主なターゲット蛋白質は、角膜と強膜の乾燥重量タンパク質の大多数を占めるフィブリル型コラーゲンです。偶然、フィブリル型コラーゲン組織の細胞外スペースの第 2 高調波発生信号の主な源であります。したがって、治療法、架橋により誘起されたものなど、コラーゲン蛋白質の変更可能性があります潜在的検出され、第 2 高調波発生顕微鏡 (SHGM) を使用して量的に表わされます。ソースは、生物医学の広まった使用法を楽しんでいる刺激的な現代のイメージング手法レーザー スキャン顕微鏡システム赤外線励起光結合を使用して信号 SHGM を監視します。したがって、本研究の測定する手段によるサブほぞの空間 (sT) に架橋剤の化学物質の注入、ウサギ強、 ex vivo架橋効果 SHGM 顕微鏡の使用を評価するために行われた、射出はアプローチは眼科臨床プロシージャ中に眼麻酔を引き起こすための標準的な方法です。化学架橋剤、ナトリウム hydroxymethylglycinate (SMG) は、エージェント (Far) を放出するホルムアルデヒドとして知られている化粧品の防腐剤のクラスからです。SMG との反応を伴う強膜の変化した SHG 信号の増加、熱変性温度の変化と相関を評価するための標準的な方法による架橋効果組織です。
Introduction
近視の進行は仮定することが (光化学および化学)、非酵素的に強膜架橋を通じて治療実験フォーム剥奪 (FD) を増やすことができますコラーゲン酵素架橋ブロックことを考えれば理にかなっている-誘導近視1。Elsheikh とフィリップスの2は最近可能性と標準的な紫外線照射 (UVA) の使用の可能性を議論-リボフラビンを介した光化学架橋 (ドレスデン プロトコル) 省略 (リボフラビン CXL) として近視で軸の伸長を停止する後部強膜安定化。この光化学メソッドは、正常に円錐角膜とレーシックの記事 keratectasia に見られる前部グローブ サーフェス (すなわち、膨らんだ角膜) の不安定化を治療するために使用されています。ただし、強膜のこの CXL プロトコルのアプリケーションが多く大きい組織表面領域を変更する必要性と同様、紫外線 (UV) 光源と後部強膜へのアクセスの難しさに関連する問題によって妨げられています。言われて、CXL アプローチに使用されている視覚的にフォームで体軸の伸長を停止奪わウサギ (瞼板縫合)、後部強膜の複数の領域は、研究3で複数の独立した照射ゾーンが必須。対照的に、聖空間を介して化学安定剤 (すなわち、架橋剤) 注入は、後部強膜、紫外線光源を導入することの必要性を回避するを変更する簡単な方法を表すことができます。この注入法白内障手術4,5,6など眼科処置中に眼麻酔を誘導する便利な方法として知られています。ウォレン サック7は以前グリセルアルデヒド (化学架橋剤ホルムアルデヒド エージェント (Far) 本を解放する概念と似ています) を使用して sT インジェクションの使い方を説明してウサギ強膜と genipin を固くにはFD モルモット8,9の軸方向の長さを制限するために示されています。これらの調査官は、光化学 CXL 法上可溶性化学薬品を使用しての明確な利点を示しています。強膜の架橋 (すなわちTXL) ファールスを含むいくつかのタイプの注射薬剤を使用して10近視で強膜の伸長の進行を食い止めるための可能な治療法を提供できます。
ここで紹介するプロトコル、死体の家兎眼の強膜に sT インジェクションを介して配信されるナトリウム hydroxymethylglycinate (SMG) の化学架橋のソリューションを使用します。我々 は、角膜局所化学架橋以前に類似したプロトコルを実装しています。これらの報告された調査で特に依存効果を架橋濃度は熱変性解析11 によって決定される光化学 CXL の達成もまたがる効果範囲を持つ SMG を使用して得ることができた.
ここで我々 は強膜組織、差動スキャン熱量測定 (DSC)、および第 2 高調波発生顕微鏡 (SHGM) を使用して熱変性する sT 注射を介して配信 SMG の架橋効果を評価するためにプロトコルを説明します。
差分走査熱量測定 (DSC)、熱分析とも呼ばれますを使用して熱変性転移測定、強膜組織は主にそれらはバルクの大部分を構成するので、フィブリル型コラーゲンの性質によって導かれてタンパク質。このメソッドには、コラーゲン分子構造の安定性とコラーゲン線維、主要タンパク質立体構造の安定化架橋結合が評価されます。DSC で加熱中に臨界転移温度は三重らせん、ゼラチンと呼ばれる一般的形成プロセスの上体で、コラーゲン分子の変性の結果が達成されます。この熱変性コラーゲン分子に水素結合を中断され、誘導架橋方法12,13を通して高温にシフトすることができます。このメソッドは、革の意思を含むプロセス、特に生体材料業界で長年にわたり使用されています。ただし、このメソッドは強膜組織の抽出を必要とし、したがって前のヴィヴォ手法として有用することができますのみ。
第二高調波発生顕微鏡 (SHGM) は、非中心対称性分子環境に、特定の物質の非線型光学特性に基づいています。そのような材料は、強烈な光でたとえば光レーザーによって生成される、SHG 信号、周波数 2 倍は入射光を生成します。コラーゲン、微小管、筋ミオシン、SHG 信号を作成する知られている生物学的材料。たとえば、コラーゲン 860 nm の波長の赤外光と興奮は 430 nm の波長の可視範囲の SHG 信号を出力します。第二高調波発生 (SHG) 信号のイメージング、治療コラーゲン架橋を評価するための有望な方法です。それは、組織のコラーゲン線維を放出 SHG 信号1430 年以上知られています。しかし、ごく最近高解像度の画像を取得でした15といったさまざまな組織、腱16皮膚、軟骨17、18血管とコラーゲン ゲル19。
この知識に基づいて、本研究は、SMG は化学的に誘導されるコラーゲンの架橋を通じて強膜で SHG 信号の変化を評価します。強膜の SMG 変更組織コラーゲン線維束 (高次第四紀構造コラーゲン線維から成る) から生成された SHG 信号を増加させるし、もコラーゲンの構造の形態学的変化を生成を示唆します。ファイバー網繊維束」矯正」に反映
Protocol
Representative Results
Discussion
コラーゲン架橋強、トリートメントを架橋用監視ツールとしてこのテクニックを使用しての将来の可能性を高める効果の評価方法として SHG 信号顕微鏡の使用を支持する証拠が示されている実験を行ったコラーゲン蛋白質をターゲットします。注記のうち、楽器は既にこの SHG 信号をキャプチャすることができます潜在的臨床使用中です。この楽器がイメージングの皮膚皮膚の真皮用では主に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はありがとう sT インジェクション; 相談 Tongalp Tezel、MD は、テレサ Swayne、PhD、SHG 顕微鏡に関する相談デザインと生物統計学のリソースとコロンビア大学医療センターでアーヴィングの研究所の統計中核施設からジミー ビンズオン。
失明を防ぐために研究や健康補助金傘下 UL1RR024156 の国家機関、ネイ P30 EY019007、NCI P30 CA013696、ネイ R01EY020495 (DCP) 部分的にサポートされています。コロンビア大学関連の知的財産を所有している: 米国発行特許 no: 8,466,203 および no: 9,125,856。国際特許出願中: PCT/US2015/020276。
画像を集めた、共焦点、およびコロンビア大学、NIH 支えのハーバート ・ アーヴィング総合がんセンターの専門顕微鏡共有リソースに付与 #P30 CA013696 (国立癌研究所)。NIH で共焦点顕微鏡を購入した #S10 RR025686 を与えます。
Materials
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements – protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
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