JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Anden harmonisk Generation signaler i kanin Sclera som et redskab til evaluering af terapeutisk væv Cross-linking (TXL) for nærsynethed

Published: January 06, 2018
doi:
10.3791/56385
, , ,
1Department of Ophthalmology,Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center,Columbia University

Summary

Denne protokol beskriver teknikker til evaluering af kemiske cross-linking af kanin sclera ved hjælp af andet harmonisk generation imaging og differential scanning kalorimetri.

Abstract

Metoder til at styrke væv ved at indføre kemiske bindinger (ikke-enzymatiske cross-linking) i strukturelle proteiner (fibrillar collagens) for terapi omfatter fotokemisk cross-linking og væv cross-linking (TXL) metoder. Sådanne metoder for at fremkalde mekaniske væv egenskabsændringer er ansat til hornhinden i cornea udtynding (mekanisk svækket) lidelser såsom keratoconus samt sclera i progressiv nærsynethed, hvor tyndere og svækkelsen af bageste sclera opstår og sandsynligvis bidrager til aksial brudforlængelse. Primære target proteiner for en sådan styrkelse af væv er fibrillar collagens, som udgør det store flertal af tørvægt proteiner i hornhinden og sclera. Tilfældigvis er fibrillar collagens den vigtigste kilde til anden harmonisk generation signaler i væv ekstracellulære rum. Derfor, ændringer af kollagen proteiner, som dem fremkaldt via cross-linking terapier, kunne potentielt være opdaget og quantitated ved hjælp af anden harmonisk generation mikroskopi (SHGM). Overvågning SHGM signaler ved hjælp af en laser scanning mikroskopi system kombineret med en infrarød excitations lys kilde er en spændende moderne billedbehandling metode, der nyder udbredt skik i de biomedicinske videnskaber. Således, den nuværende undersøgelse blev foretaget for at evaluere brugen af SHGM mikroskopi, som et middel til at måle inducerede tværbindingsmidler effekter i ex vivo kanin sclera, efter en indsprøjtning af et kemikalie cross-linking agent i sub-Tenons plads (sT), en injektion tilgang er standardpraksis for forårsager okulær anæstesi under oftalmologisk kliniske procedurer. De kemiske cross-linking agent, er natrium hydroxymethylglycinat (SMG), fra en klasse af kosmetiske konserveringsmidler kendt som formaldehyd frigive agenter (FARs). Scleral ændringer efter reaktion med SMG resulterede i en stigning i SHG signaler og korreleret med skiftehold i termisk denaturering temperatur, en standard metode til evaluering af induceret væv cross-linking effekter.

Introduction

Progressive nærsynethed er postuleret for at være behandlelige gennem ikke-enzymatiske scleral cross-linking (fotokemisk og kemiske), hvilket giver mening at blokere kollagen enzymatisk cross-linking kan øge eksperimenterende form afsavn (FD)-induceret Nærsynethed1. ElSheikh og Phillips2 for nylig drøftet gennemførlighed og potentiale til at anvende standard ultraviolet-en bestråling (UVA)-riboflavin medieret fotokemisk cross-linking (også kendt som Dresden-protokollen), forkortet her som (riboflavin CXL) for posterior scleral stabilisering at standse aksial brudforlængelse i nærsynethed. Denne fotokemiske metode har held været anvendt til behandling af destabilisering af anterior globe overfladen (dvs., de svulmende hornhinden) set i keratoconus og post-LASIK keratectasia. Dog hæmmes CXL protokollens for sclera af problemer i forbindelse med vanskeligheder i at få adgang til den bageste sclera med en ultraviolet (UV) lyskilde, samt behovet for at ændre en meget større væv areal. At bliver sagt, CXL tilgang har været brugt til at standse aksial brudforlængelse i visuel form berøvet kaniner (af tarsorrhaphy), selv om flere områder af posterior sclera krævede flere separate bestråling zoner i denne undersøgelse3. Derimod kunne injektion af en kemisk stabilisator (dvs, tværbindingsmidler agent) via sT plads repræsentere en enklere måde at ændre den posteriore sclera, undgå behovet for at indføre en UV-lyskilde. Denne injektionsteknik er kendt som en nyttig måde at inducere okulær anæstesi under oftalmologisk procedurer såsom grå stær kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrevet tidligere har brug for en St. injektion ved hjælp af glyceraldehyd (en kemisk tværbindingsmidler agent samme i konceptet til formaldehyd frigive agenter (FARs) beskrevet i denne undersøgelse) at stivne kanin sclera og genipin har vist sig at begrænse aksial længde i FD marsvin8,9. Disse forskere har påvist en klar fordel ved at anvende en opløselig kemisk agens over den fotokemiske CXL teknik. Således scleral cross-linking bruger en injicerbar kemisk agens af nogle typer, herunder FARs (dvs., TXL)10, kunne give en mulig behandlingsmetode til at standse progressionen af scleral brudforlængelse set i nærsynethed.

I protokollerne præsenteres her, bruger vi en kemiske tværbindingsmidler opløsning af natrium hydroxymethylglycinat (SMG), leveret via sT injektion til sclera af dødt kanin øjne. Vi har gennemført lignende protokoller tidligere for aktuel kemiske cross-linking i hornhinden. Især i de tidligere rapporterede undersøgelser, kunne koncentration afhængige cross-linking virkninger være opnået ved hjælp af SMG, med en effekt sortiment spænder godt ovenfor der kan opnås med fotokemisk CXL, som bestemmes af termisk denaturering analyse11 .

Her beskriver vi protokoller for at vurdere den tværbindingsmidler virkning af SMG leveret via sT injektioner til scleral væv, termisk denaturering bruger Differential Scanning kalorimetri (DSC), og anden harmonisk Generation mikroskopi (SHGM).

Ved hjælp af differential scanning kalorimetri (DSC), også kendt som termisk analyse, er en termisk denaturering overgang målt, som for scleral væv er hovedsageligt styret af egenskaberne for de fibrillar collagens, da de udgør hovedparten flertal af protein. Denne metode evaluerer stabiliteten af kollagen molekylære struktur og de krydsrefererede obligationer, at stabilisere kollagen fibriller, principal tertiære protein struktur. Under varme i DSC, er en kritisk overgang temperatur opnået der resulterer i denaturering af kollagen molekyle, hvilket resulterer i uncoiling af triple helix, en proces, der danner hvad er almindeligt kendt som gelatine. Dette termiske denaturering forstyrrer hydrogenbindinger langs kollagen molekyle og kan flyttes til højere temperaturer gennem induceret tværbindingsmidler metoder12,13. Denne metode har været brugt i mange årtier, især i biomaterialer-industri og for processer, der omfatter læder-making. Men denne metode kræver udvinding af sclera væv og kan derfor kun være nyttige som en ex vivo -teknik.

Anden-harmonisk generation mikroskopi (SHGM) er baseret på de ikke-lineære optiske egenskaber af særlige materialer med ikke-centrosymmetric molekylære miljøer. I sådanne materialer, intense lys, for eksempel lys produceret af lasere, genererer SHG signaler, som den indfaldende lys er fordoblet i frekvens. Biologiske materialer, der er kendt for at skabe SHG signaler er kollagen, mikrotubuli og muskel myosin. For eksempel, vil kollagen spændt med et infrarødt lys af 860 nm bølgelængde udsender en SHG signal i det synlige spektrum med 430 nm bølgelængde. Anden harmonisk generation (SHG) signal imaging er en lovende metode til evaluering af terapeutisk kollagen cross-linking. Det har været kendt i mere end 30 år, kollagen fibriller i væv udsender SHG signaler14. Dog kunne først for nylig billeder i høj opløsning opnås15 i en række forskellige væv, herunder senen16, hud, brusk17, blodkar18, og i kollagen geler19.

Baseret på denne viden, vurderer denne undersøgelse SHG signal ændringer induceret i sclera gennem SMG kemisk induceret cross-linking af kollagen. Resultaterne viser, at SMG ændring af sclera øger SHG signaler fremstillet af væv kollagen fiber bundter (højere orden kvaternære struktur består af kollagen fibriller) og producerer også en morfologiske strukturændringer i kollagen fibernet, afspejles i fiber bundle “glatning.”

Protocol

Alle procedurer blev udført ved hjælp af dødt kanin øjnene inden for intakt outbred kanin hoveder. Alle institutionelle og nationale retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr blev fulgt. 1. forberedelse af løsninger SMG forberedelse til TXL: Forberede 1 mL 0,2 M koncentration af natriumbikarbonat løsning (NaHCO3) løsning med 0.0165 g NaHCO3 pulver opløses i 1 mL destilleret vand. 0.1016 mg pulveriserede natrium hydroxymethylglycinat (SMG)…

Representative Results

Termisk denaturering temperatur (Tm) som en analyse metode til at evaluere TXL cross-linking effekt: Ialt 16 par af kanin øjnene blev brugt i disse eksperimenter TXL procedure. Som et første led i denne undersøgelse, blev lokalisering af tværbindingsmidler effekt induceret af en enkelt injektion af SMG tværbindingsmidler agent via sT plads i dødt kanin hoved evalueret. Denne type af eksperiment har relevans for den kliniske behandling af patienter, da injektioner i …

Discussion

Gennemført eksperimenter har vist beviser understøtter brugen af SHG signal mikroskopi som en metode til evaluering af kollagen cross-linking effekter i sclera, hæve fremtidige muligheden af at anvende denne teknik som et overvågningsværktøj for danne tvaerbindinger behandlinger at målrette kollagen proteiner. Af note er et instrument, der allerede i klinisk brug, der potentielt kan fange denne SHG signal. Selv om dette instrument var primært designet til billedbehandling hud menneskelige dermis, har det været a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke Tongalp Tezel, MD, for høring om sT injektion; Theresa Swayne, ph.d., for konsultation angående SHG mikroskopi; og Jimmy Duong fra Design og Biostatistik ressource og Biostatistisk core facilitet af Irving Institute ved Columbia University Medical Center.

Støttet en del forskning for at forebygge blindhed og nationale institutter for sundhed tilskud NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 og NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University ejer tilknyttede immaterialret: U.S. udstedte patenter no: 8,466,203 og ingen: 9,125,856. International patentanmeldt: PCT/US2015/020276.

Billeder blev indsamlet i Confocal og specialiseret mikroskopi delt ressource af Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, støttet af NIH give #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Konfokal mikroskop blev købt med NIH give #S10 RR025686.

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control?. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon’s administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon’s anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon’s capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94 (1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon’s cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon’s, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking–a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).

Tags

Second Harmonic GenerationSHGMicroscopyScleraTXLMyopiaCollagenSub-tenon’s InjectionFormaldehydeDifferential Scanning CalorimetryNon-invasiveRabbit EyeEyelid SpeculumConjunctivaExtra Ocular MusclesScleral InsertionPBSObjective LensNumerical ApertureImmersion Gel
check_url/56385?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image